热疗对耐药骨肉瘤细胞株的作用

李武营，王建，潘 佳，王亚秋，李艳华，程传耀，周 芳

1.河南大学 学报编辑部，河南 开封 475001；2.河南大学淮河医院，肿瘤科 河南 开封 475000

热疗对耐药骨肉瘤细胞株的作用

1.河南大学 学报编辑部，河南 开封 475001；2.河南大学淮河医院，肿瘤科 河南 开封 475000

〔目的〕 探索热疗与热化疗对骨肉瘤原代细胞系耐药细胞系的影响。〔方法〕 MTT法检测不同温度下热疗对原代细胞系和耐药细胞系生存率的影响；并测定43 ℃温度作用下浓度为1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的甲氨蝶呤(MTX)和浓度为1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的阿霉素(ADM)对原代细胞系与耐药细胞系生存率的影响；免疫组化检测43 ℃热疗作用下，原代细胞系与耐药细胞系HSP70的表达。〔结果〕 原代细胞系与耐药细胞系热疗后细胞生存率下降；随着化疗药物浓度增加，细胞系生存率下降；热疗作用下HSP70在原代细胞系和耐药细胞系均表达增加。〔结论〕 热疗可能是克服骨肉瘤细胞系耐药的一种途径。HSP 70在热处理后，原代细胞系和耐药细胞系均增加，两种细胞系HSP70表达未见差异。

骨肉瘤；热疗；耐药

骨肉瘤是发生在青少年常见的骨恶性肿瘤。外科手术治疗、内科化疗等综合治疗措施的应用使肿瘤的预后有很大提高，但是耐药问题仍然是制约细胞系疗效的关键因素。由于骨肉瘤自身代谢及自身组织结构特点的原因，热疗成为适合骨肉瘤的治疗方法。我们实验通过热疗及化疗的综合作用，观察对原代细胞系及耐药细胞系生存率的影响，并探索热疗对细胞系HSP 70的表达改变。

1 材料与方法

1.1 细胞株与药物

Saos-2原代细胞系，购自中国科学院上海细胞生物所;Saos-2/MTX4.4细胞系，我们实验室在原代细胞系通过逐渐升高药物浓度冲击法培养成功，液氮环境下保存，实验前复苏细胞系，并检测具备耐药细胞系特点；MTX，上海华联制药；ADM，浙江海正药业；四甲基偶氮唑盐(MTT)，上海博鑫生物制品公司；二氧化碳培养箱，美国Therm公司；OLYMPUS IX-70倒置相差显微镜，日本奥林巴斯株式会社；电热恒温水槽 DK-600，上海精宏实验设备有限公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 细胞培养

骨肉瘤Saos-2细胞系及Saos-2/MTX4.4细胞系,常规37 ℃体积分数为5% CO2的培养箱中培养，用1640培养溶液与体积分数为10%胎牛血清，细胞株生长到对数细胞生长期实验备用。

1.3 细胞株不同温度热疗处理肿瘤细胞的存活率 的测定

分别取原代及耐药细胞系5×105/mL的细胞接种96孔板，每孔200 μL，各实验设平行4孔，细胞系在水浴中加热(恒温数字水浴锅，温度波动<±0.1 ℃)。设定在不同温度下(37 ℃，42 ℃，43 ℃)1 h，热处理过的细胞系放入37 ℃培养箱，培养24 h后，每孔中加入5-二苯基四氮唑澳盐(MTT)，MTT的终浓度为5 mg/L，并继续在37 ℃孵育4 h，然后将上清液弃去并溶解150 μL二甲基亚砜。用酶标仪测定540 nm吸收波长A值。肿瘤细胞的存活率(%)=热处理实验A值/37 ℃实验A值。同时设置PBS空白对照。

1.4 细胞株加入化疗药物的不同温度处理细胞存 活率的测定

分别取原代及耐药细胞系5×105/ mL的细胞接种96孔板，每孔200 μL，各实验设平行4孔，细胞系分别加入MTX，终浓度为1、5、10 μg/mL和阿霉素终浓度为1、5、10 μg/mL在水浴中加热(恒温数字水浴锅，温度波动<±0.1 ℃)，设定在43 ℃温度下1 h。热处理过的细胞系放入37 ℃培养箱，培养24 h后，每孔中加入MTT,MTT的终浓度为5 mg/L，并继续在37 ℃孵育4 h，然后将上清液弃去并溶解150 μL二甲基亚砜。用酶标仪测定540 nm吸收波长A值。肿瘤细胞的存活率(%)=热化疗组A值/37 ℃组A值。绘制细胞存活率与药物浓度依赖曲线。

1.5 免疫组化方法测定热处理后耐药细胞系与原 代细胞系在HSP70表达情况

常规方法制作原代细胞株与耐药细胞株细胞爬片，在6孔板内放入消毒后的盖玻片，培养至细胞系对数期进行试验，分两种处理方法，一种37 ℃培养不进行热处理，另一种进行43 ℃热处理1 h，处理后放入37 ℃培养箱24 h培养，细胞系做免疫组化实验。每次实验平均作3张爬片，用不加一抗细胞爬片作阴性对照，用分别阳性组织切片作阳性对照。HSP70一抗(sino,Bidogical Inc )，免疫组化用链菌素-亲生物素过氧化物酶法(S-P)，操作按试剂盒要求进行，试剂盒够自于福州迈新公司。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 MTT法检测不同细胞系生存率结果

热疗处理(42 ℃，43 ℃，44 ℃)24 h后细胞系生存率均降低，与37 ℃处理细胞系比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 原代细胞与耐药细胞系热处理后的生存率

注：*间未见统计学差异(P>0.05)，*与**有统计学差异(P<0.05)。

2.2 MTT法检测热疗与热化疗作用细胞系的结果

MTT法检测不同细胞系43 ℃热疗处理分别加入终浓度为1、5、10 μg/mL的甲氨蝶呤(MTX)和终浓度为1、5、10 μg/mL的阿霉素(ADM)24 h后，MTT法检测细胞系生存率，绘制生存率与药物浓度曲线(见图1、图2)。发现：细胞系43 ℃热处理组与原代细胞与耐药细胞热化疗组(MTX,ADM)均有统计学意义(P<0.05)，原代细胞系与耐药细胞系在热疗实验(MTX,ADM)未见明显差异(P>0.05)。

2.3 免疫组化对热疗处理细胞系的HSP 70表达 检测结果

免疫组化方法测定耐药与原代细胞系HSP70表达情况(见图3,图4,图5,图6)。HSP 70在Saos细胞系43 ℃热处理后明显表达增加，与37 ℃培养情况下有明显差异(P<0.05)；HSP 70在Saos-2/MTX4.4细胞系43 ℃热处理后表达明显增加，与37 ℃培养情况下有明显差异(P<0.05)；HSP 70在Saos细胞系与Saos-2/MTX4.4细胞系在37 ℃培养表达均无明显差异(P<0.05)；HS P70在Saos-2/MTX4.4细胞系在43 ℃热处理后表达明显增加，热处理两细胞系间未见明显差异(P<0.05)。

图1 43 ℃热化疗MTX浓度为1 ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL的细胞生长曲线

图2 43 ℃热疗ADM浓度为1 ug/mL、5 ug/mL、10 ug/mL的细胞生长曲线

图3 Saos细胞系在37 ℃培养HSP 70表达

图4 Saos细胞系在43 ℃培养HSP 70表达

图5 Saos-2/MTX4.4细胞系在37 ℃培养HSP 70表达

图6 Saos-2/MTX4.4细胞系在43 ℃培养HSP 70表达

3 讨论

热疗方法在多种肿瘤治疗中经过了验证，获得了客观的疗效。总结热疗的作用机制:肿瘤内部血流速度变慢、血流量减低。在进行加热后，肿瘤组织的温度明显升高，同时正常组织变化不明显，可在不损伤正常组织细胞的前提下抑制肿瘤细胞[1];高热量使肿瘤组织热量聚集、pH降低，直接损伤肿瘤细胞;高温同时干扰肿瘤细胞中DNA,RNA及蛋白质的合成;高温可改变细胞结构，不可逆地破坏肿瘤细胞的细胞器;温度影响肿瘤细胞的生物膜，改变膜通透性[2];高温提高机体免疫系统活性[3]；热化疗作用机制为高温加速肿瘤组织附近血液循环，渗透性升高使得化疗药物更容易进入细胞[4]。

骨肉瘤的热疗也经过了探索，从开始时间的化疗药物热灌注治疗，获得了局部疗效较好，全身毒性较少的临床疗效[5]。但是也出现局部操作复杂，药物容易外渗等不良因素，使该方法没有进一步广泛应用。还有医生在肿瘤外科手术时使用局部热疗，提高局部控制率并且使用肿瘤骨作支撑架，提高了患者手术后的生活质量[6]。临床上外科技术和化疗的应用已经使患者有较好的预后，但是，改变复发患者或耐药患者的预后称为临床治疗的难点。我们实验探索不同温度下原代细胞系和耐药细胞系在单纯热疗情况下的差别，实验得出42 ℃、43 ℃、44 ℃热疗后肿瘤细胞生存率有下降，证明热疗能提高治疗骨肉瘤细胞系的效果。但是，原代细胞系和耐药细胞系热疗效果并没有差别。可能原因是耐药细胞系耐药原因和热疗作用机制不同。我们实验还探索了在43 ℃热作用下常用化疗药物MTX、ADM药物在不同浓度下生存的影响，实验结果，热化疗能提高热疗的效果，效果和药物浓度有梯度依赖性。但是，两种药物没有效果的差异。耐药细胞系和原代细胞系的热化疗效果没有差异。热休克蛋白是生物受到环境中物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的蛋白质,加热可以提高热休克蛋白的表达[7]。我们的实验通过免疫组化方法检测热疗对细胞系HSP 70表达的影响发现两种细胞系受热后HSP 70表达均增加，可能是HSP 70表达与应激反应有关，与上述实验中表达结果一致[7]。但是，热疗后耐药细胞系和原代细胞系HSP 70表达没有差别。这样可能揭示了耐药的原因和热疗的作用途径不同。

我们的实验结论：体外实验热疗对骨肉瘤细胞系可以降低细胞生存率；热疗对耐药细胞系和原代细胞系都具有效果，热化疗能降低细胞生存率，对原代细胞系和耐药细胞系生存率下降没有差别；热疗使HSP 70表达升高，在原代细胞系和耐药细胞系变化未见明显差别。

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[责任编辑 段金卯]

Effect of hyperthermia on primary osteosarcoma cell lines and drug-resistant cell lines.

1.Journal Editorial Department of Henan University, Kaifeng 475000, China； 2. Oncology Department of Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475000, China

〔Objective〕The antiosteosarcoma effects of hyperthermia were explored on primary osteosarcoma cell lines and drugresistant cell lines.〔Methods〕Using different temperatures and different concentrations of methotrexate (1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL) and doxorubicin (1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL),the survival rate of primary cell lines and drug-resistant cell lines HSP70 were determined by MTT assay.〔Results〕The cell survival rate of primary cell line and drug resistant cell line was decreased after thermal therapy. The expression of HSP70 was increased in primary osteosarcoma cell line and drug resistant cell line under hyperthermia.〔Conclusion〕Hyperthermia is an effective strategy to treat the resistance of osteosarcoma cell lines.

osteosarcoma; hyperthermia; drug resistance

1672-7606(2016)04-0236-04

2016-10-17

河南省科技攻关项目(162102310394)

李武营(1962-)，河南开封人，副教授，从事药理学研究及教学工作。

王建军(1968-)，河南开封人，副教授，从事临床肿瘤学研究及教学工作。

R738.1

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