热疗对小鼠骨肉瘤的疗效及肿瘤组织HSP 70基因表达

潘 佳,李艳华,程传耀,王亚秋，周 芳,王建

河南大学淮河医院 肿瘤科，河南 开封 475000

热疗对小鼠骨肉瘤的疗效及肿瘤组织HSP 70基因表达

河南大学淮河医院 肿瘤科，河南 开封 475000

〔目的〕 探索热疗对原代细胞系及耐药骨肉瘤细胞系成瘤体积的影响，并用免疫组化方法检测不同细胞系热疗后HSP 70基因表达。〔方法〕 原代细胞系和耐药细胞系接种小鼠16只，按体积相似分成4组。实验组用热疗43 ℃ 30 min对照组未进行热疗处理，根据肿瘤体积大小及生存时间绘制曲线。用免疫组化方法测定热疗后不同细胞系成瘤的组织在HSP 70的基因表达情况。〔结果〕 热疗处理后肿瘤生长与对照组相比有明显的差异(P<0. 05)。耐药组与原代组比较未见明显差异(P>0. 05)；热疗后实验组肿瘤组织HSP 70蛋白表达明显高于未热疗处理组实验小鼠组织(P<0.05),Saos-2细胞系成瘤鼠组和Saos-2/MTX4.4细胞系成瘤鼠组热处理和无热处理组间未见明显差异(P>0.05)。〔结论〕 热疗对耐药细胞系和原代细胞系成瘤均有杀伤作用。热疗后两种细胞系都表现出HSP 70表达升高。

动物实验；骨肉瘤；热疗；HSP 70

骨肉瘤是发生在青少年骨的常见肿瘤，疾病引起患者肢体功能障碍，严重的危及患者的生命。由于手术治疗和化疗的综合方法应用，治疗效果明显改善，但是由于耐药问题的存在，疗效不能进一步提高，需要寻找新的治疗方法和途径是解决问题的关键。热疗在骨肉瘤治疗中进行了临床应用，并提高了治疗效果。我们试图通过局部热疗的方法，观察对成瘤原代细胞系和成瘤耐药细胞系的热疗效果，并用免疫组化方法检测HSP基因在成瘤原代细胞系及成瘤耐药细胞系不同表达，探索可能影响热疗效果的因素。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验细胞系

Saos-2原代细胞系购自中国科学院上海细胞生物所。Saos-2/MTX4.4细胞系，我们实验室在原代细胞系逐渐升高药物浓度，冲击法培养成功，液氮环境下保存后，实验前复苏细胞系，并检测具备耐药细胞系特点。

实验动物C57BL6小鼠16只，雄性，周龄8周，体重(20±2) g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，清洁级饲养。所有动物实验均参照我国《实验动物管理条例》中有关动物福利的条规进行。

1.2 实验试剂

HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，购自北京博奥森生物技术公司，免疫化学试剂盒(ACE-0037)购自福州迈新公司。

1.3 实验仪器

二氧化碳培养箱，美国Therm公司；OLYMPUS IX-70倒置相差显微镜，日本奥林巴斯株式会社；TGHM型电热光聚焦加热灯(日本Olympus公司;温度测量及记录系统(美国Physitemp公司)。

1.4 细胞培养及处理

骨肉瘤Saos-2细胞系及Saos-2/MTX4.4细胞系。常规37 ℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养，用1 640培养溶液与体积分数10%的胎牛血清，细胞株生长至对数期实验备用。

1.5 体内实验

1.5.1 动物模型制备 取对数生长期的Saos-2细胞系及Saos-2/MTX4.4细胞系，用2.5 g/L胰酶消化，重悬于PBS中。调节细胞浓度至1×107个/mL，两种细胞系分别接种于16只实验小鼠背部皮下，0.2 mL/只。接种1周，肿瘤直径达到5 mm左右；选Saos-2细胞系与Saos-2/MTX4.4细胞系肿瘤大小一致的4只小鼠分别做1实验组和对照1组实验、实验2组和对照2组实验。

1.5.2 荷瘤小鼠热疗 10 g/L戊巴比妥钠(0.1～0.16 mL/只)麻醉小鼠后，以TGHM型电热光聚焦加热灯对荷瘤小鼠移植瘤进行局部加热。加热3～5 min后温度达预定值(43 ℃)后开始计时，并通过随时调节光圈使温度保持在预定温度±1 ℃;同时用2个热电偶分别插入肿瘤中心和直肠，对肿瘤中心温度及全身温度(直肠温度)进行监测;分别给予实验组小鼠43 ℃ 30 min热疗，然后将热电偶取下，待其苏醒后常规饲养。每只小鼠间隔24 h接受1次热疗，共接受3次。对照组除不加热外其余步骤同实验组。

1.5.3 观察肿瘤生长情况 热疗后动态观察小鼠整体状态，以及肿瘤体积的改变。热疗后0,7,14,21 d测量肿瘤大小。小鼠肿瘤体积=1/2(长径×短径×短径)。

1.5.4 免疫组化测定肿瘤组织HSP表达 第21天不同细胞系实验组和对照组小鼠断颈处死，切取不同实验组肿瘤组织，常规方法固定处理，制作病理切片，用不加一抗组织片作阴性对照，用阳性组织切片作阳性对照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫组化用链菌素-亲生物素过氧化物酶法(S-P)方法，操作按试剂盒要求进行，试剂盒来购自福州迈新公司。

1.6统计方法

实验数据采用SPSS 11.0统计软件处理，计量数据以t检验表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD,P<0.05，视为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 热疗对肿瘤生长抑制情况

对肿瘤体积的动态测量结果(图1)显示，43 ℃持续30 min的热疗，3次热疗后对小鼠成瘤的生长显示出抑制作用，肿瘤生长与对照组相比有明显的差异(P<0. 05)。耐药组与原代组比较未见明显差异(P>0. 05)，热疗与无热疗小鼠结果见图2与图3。

图1 成瘤实验小鼠肿瘤体积与生存时间曲线图

2.2 成瘤鼠肿瘤组织HSP 70免疫组化表达

实验小鼠于21 d处死，取肿瘤组织做实验，每组做3个平行实验，用不加一抗组织片作阴性对照，用阳性组织切片作阳性对照。HSP 70一抗(Sino,Bidogical Inc )，免疫组化用链菌素-亲生物素过氧化物酶法(S-P)，操作按试剂盒要求进行，按染色程度进行评分:无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，浅褐色为3分，深褐色为4分。以阳性细胞所占百分比进行评分:阳性细胞比例占25%为1分，阳性细胞占26%～50%为2分，阳性细胞占51%～75%为3分，阳性细胞占所占76%～100%为4分。以上述两项评分之和表示最后得分。实验重复3次，结果见图4、图5)。热疗后实验组肿瘤组织HSP 70蛋白表达明显高于未热疗处理实验小鼠组织(P<0.05),Saos-2细胞系成瘤鼠组和Saos-2/MTX4.4细胞系成瘤鼠组热处理和无热处理组间未见明显差异(P>0.05)。

图2 热疗后成瘤鼠

图3 无热疗成瘤鼠

3 讨论

热疗在骨肉瘤的临床治疗方面进行了应用，用局部消融和微波治疗方法，提高了治疗效果，提高了保肢率[1-2]，但是临床实践[3-4]发现,在治疗时，局部热疗温度不好控制，因此，没有被广泛推广应用。我们实验用原代细胞系和耐药细胞系建立荷瘤小鼠模型，用电热光聚焦加热灯对荷瘤小鼠移植瘤进行局部加热，温度达预定值(43 ℃)后开始计时30 min，每24 h热疗1次，共进行3次。观察肿瘤体积变化，发现热疗对原代(Saos-2)细胞系成瘤鼠肿瘤和对耐药细胞系(Saos-2/MTX4.4)均有明显的抗肿瘤作用，且对两种成瘤细胞系肿瘤杀伤效果未见明显差别。提示：热疗可能是克服耐药骨肉瘤的一种治疗方法。Takemoto等[5]在动物实验骨肉瘤模型上对多种药物也进行了热化疗实验，试验温度为41.5 ℃、时间30 min，得出结论：热疗对骨肉瘤肿瘤有提高疗效的作用，烷化剂在高温下可能是多种肿瘤的首选药物。热休克蛋白是生物受到环境中物理、化学、生物、精神等刺激时发生应激反应而合成的蛋白质。加热可以提高热休克蛋白的表达，热体克蛋白种类有HSP 100家族 ，HSP 90家族, HSP 70家族, HSP 60家族，小分子量HSP家族,通过对原代细胞系成瘤鼠肿瘤组和耐药细胞系成瘤鼠肿瘤组的热疗与未热疗组织，用免疫组化方法对HSP 70基因表达进行检测，热疗后实验组肿瘤组织HSP 70蛋白表达明显高于未热疗处理组实验小鼠组织,Saos-2细胞系成瘤鼠组和Saos-2/MTX4.4细胞系成瘤鼠组热处理组和无热处理组间未见明显差异。说明热疗后细胞产生生理保护机制，促进细胞产生耐热的生物活性，所以，防止耐热活性的产生需要在短时间内对肿瘤组组进行杀伤，杀伤方案可以提高热疗温度，也可以提高每次热疗的时间，防止耐热肿瘤细胞系产生，我们实验结果与Trieb[6]做出的结果相似。

图4 阳性实验组组织切片

图5 阴性实验组组织切片

[1] Fan Q, Ma B, Guo A. Zhonghua wai ke za zhi .Treatment of malignant or aggressive bone tumors with microwave induced hyperthermia[J]. Chinese journal of surgery, 1997,35 (8):484-487.

[2] Tateishi A, Miki H, Imamura T, Cho S, et al. Hyperthermic isolated regional perfusion for the treatment of osteosarcoma in the lower extremity[J].Nakano H, 1999,178(1):27-32.

[3] Lu S , Wang J, Hu Y. Microwave heating and neoadjuvant chemotherapy for malignant bone tumor[J]. Chinese journal of surgery,1997,35(4):196-199.

[4] van Ginkel R J, Schraffordt Koops H, de Vries E G, et al. Hyperthermic isolated limb perfusion with cisplatin in four patients with sarcomas of soft tissue and bone[J]. Eur J Surg Oncol，1996,22(5):528-531.

[6] Trieb K1, Lechleitner T, Lang S, et al. Heat shock protein 72 expression in osteosarcomas correlates with good response to neoadjuvant chemotherapy[J]. Hum Pathol, 1998,29(10):1050-1055.

[责任编辑 李武营]

Effect of hyperthermia on osteosarcoma in mice and the expression of HSP 70 gene in tumor tissue

Oncology Department of Huaihe Hospital of Henan University， Kaifeng 475000, China

〔Objective〕The antiosteosarcoma effects of hyperthermia were explored by detecting tumor cell volume and HSP 70 gene expression in different cell lines.〔Methods〕Sixteen mice were inoculated into the primary cell line and drug resistant cell line. These mice were divided into 4 groups according to their volume. The hyperthermia treatment group was treated at 43 ℃ for 30 min. The expression of HSP 70 gene in different tumor cell lines was determined using immunohistochemistry.〔Results〕Compared with the control group, the tumor growth was significantly different after hyperthermia treatment (P<0.05) in the experimental group. The expression of HSP 70 protein in the experimental group was significantly higher than that in the untreated group (P<0.05), but the difference was not significant (P>0.05) (P<0.05), and there was no significant difference between heat treated group and non-heat-treated group (P>0.05). 〔Conclusion〕Hyperthermia has the killing effect on the tumor cell lines and the primary cell lines. The hyperthermia treatment can increase the HSP 70 expression i in the same cell line.

Animal experiment; Osteosarcoma; Hyperthermia; HSP70

1672-7606(2016)04-0232-04

2016-10-17

河南省科技攻关项目(162102310394)

潘佳(1973-)，河南开封人，主治医师，从事临床肿瘤疾病的诊治工作。

R783.1

A

王建军(1968-)，河南开封人，副教授，从事临床肿瘤学的的研究及教学工作。