RP-HPLC法同时测定山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量

李 佳，蒲晓，宗兰兰，袁 琦，杨 浩

河南大学 药物研究所，河南 开封 475004

RP-HPLC法同时测定山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量

河南大学 药物研究所，河南 开封 475004

〔目的〕 建立同时测定山茱萸中莫诺苷和马钱苷含量的方法。〔方法〕 采用反相HPLC法和依利特ODS-BP(250 mm×4.6 mm)色谱柱，以甲醇-水为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长为237 nm。〔结果〕 莫诺苷和马钱苷质量浓度分别在0.099 0～0.495 0 mg/mL、0.040 0～0.240 0 mg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数分别是0.999 9、0.999 8，平均回收率分别为97.4%(RSD=1.68%，n=9)、98.6%(RSD=1.30%，n=9)。〔结论〕HPLC法测定山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量，线性关系良好、准确度高、稳定性好、重复性好，可作为该药品的质量控制方法。

HPLC法；山茱萸；莫诺苷；马钱苷；含量测定

中药山茱萸(Fructus corni)为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，别名蜀枣、鼠矢、鸡足、山英肉、实枣儿、枣皮、英肉等。该药始载于《神农本草经》，列为中品，味酸、涩，入肝、肾经，有补肝肾、涩精固脱之功效。临床上既可治疗肾虚之遗精滑泄、腰膝酸软、头晕耳鸣等症，又可用于大汗欲脱或久病虚脱之急证，是中医常用的滋补良药。山茱萸具有免疫调节、抗休克和强心、抗心律失常、降低血糖、抗癌、抗炎和杀菌、抗衰老、治疗不育症等活性，对艾滋病及癌症等也有一定疗效，同时又是常用中成药“六味地黄丸”“桃豆地黄汤”等的原料，中药生产用量和市场需求量大，具有广阔的开发前景[1]。

山茱萸的化学成分主要含有环烯醚萜苷类、皂苷、多糖、熊果酸、齐墩果酸、鞣质等。其中具有疗效的成分主要是齐墩果烷系皂苷(其水解后的苷元为齐墩果酸和熊果酸)、马钱甘苷及莫诺苷等苦味素物质[2-6]。《中华人民共和国药典》2000版、2005版和2010版分别以熊果酸和马钱苷作为山茱萸质量控制指标。水溶性成分马钱苷和莫诺苷为山茱萸的主要活性成分。莫诺苷具有保护细胞免于H2O2诱导的细胞毒性和细胞凋亡的作用，可作为一种神经保护类药物，马钱苷为环烯醚萜苷类，具有调节免疫、抗炎和抗休克作用。因此，我们采用甲醇超声提取法对山茱萸中的莫诺苷和马钱苷进行提取，并用HPLC测定其含量，为山茱萸的质量控制提供一种可行的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，BP-211D电子天平(德国Sartorius公司)，AS3120型超声波清洗器(天津奥特塞恩仪器有限公司)。

1.2 试剂

莫诺苷对照品(中国食品药品检定研究所，批号：111640-201005)，纯度98.5%；马钱苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111640-201005)，纯度99.2%；山茱萸饮片(河南南阳)；甲醇(天津四友)，色谱纯；水(自制)，重蒸水。其余试剂(市售)，分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

图1 混合对照品及山茱萸样品的HPLC图谱

色谱柱：依利特C18色谱柱(SinoChrom ODS-BP 250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：A为去离子纯净水，B为甲醇。梯度洗脱：0～8 min，32% A；15～30 min，36% A。柱温：25 ℃。流速：1 mL/min。检测波长：237 nm。理论塔板数：按马钱苷计算应不低于3 000。在此色谱条件下，得到马钱苷和莫诺苷空白溶剂、对照品及供试品溶液的HPLC图谱，见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的莫诺苷对照品9.9 mg、马钱苷对照品10.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，混合均匀，作为对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取山茱萸样品粗粉0.45 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，按1∶30的料液比加入甲醇；超声(40 kHz，100 W)1 h，取出，放置至室温，定容，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤。取其续滤液即为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取莫诺苷储备液和马钱苷储备液各6份。将莫诺苷稀释到0.099 0 、0.198、0.257、0.297、0.396、0.495 mg/mL，将马钱苷稀释到0.040 0、0.080 0、0.120、0.160、0.200 mg/mL、0.240 mg/mL，作为混合标准品溶液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图。按外标法，以峰面积Y对进样浓度X进行线性回归，得：莫诺苷的回归方程，Y=1.70×10-7X-6.14×104(r=0.999 9)；马钱苷的回归方程，Y=2.01×10-6X-3.87×105(r=0.999 8)。结果表明，莫诺苷在0.099 0～0.495 mg/mL范围内具有良好的线性关系，马钱苷在0.040 0～0.240 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

分别精密吸取线性项下含莫诺苷和马钱苷为0.198、0.200 mg/mL的混合标准品溶液10 μL，连续重复进样6次，记录峰面积。计算得，莫诺苷和马钱苷峰面积积分值的RSD分别为0.93%、0.26%，表明在此条件下仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

供试品溶液配置后放置于室温，于2、4、6、8、10、12 h分别进样10 μL，记录峰面积。计算得，莫诺苷和马钱苷峰面积积分值的RSD分别为1.93%、1.40%，表明供试品在12 h内较稳定。

2.7 重复性实验

取同一批次(120325)供试品，按上述方法配制供试品溶液6份，每份溶液进样10 μL，记录峰面积。计算得，莫诺苷和马钱苷含量的RSD分别为1.12%、1.30%，表明该法重复性较好。

2.8 回收率实验

取同一批次(120325)已测定含量的供试品约0.2 g，精密称定，共9份。按照样品中所含莫诺苷和马钱苷含量的80%、100%、120%分别加入莫诺苷和马钱苷对照品适量，按2.2节所述方法制备9份供试品溶液，进样量10 μL，记录峰面积。计算得，莫诺苷和马钱苷的平均加样回收率分别为97.4%、98.6%，其RSD值分别为1.68%、1.30%。

2.9 供试品含量测定

按拟定的含量测定方法，分别测定三批供试品中莫诺苷和马钱苷的含量。每批取3份供试品制成供试品溶液，每份溶液进样10 μL，记录峰面积，计算莫诺苷和马钱苷的含量，结果见表1。

表1 供试品含量测试

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

文献报道中，同时测定山茱萸中马钱苷和莫诺苷的含量大多采用双波长、波长转换或二极管阵列等多波长的检测方法[7-9]。我们对马钱苷和莫诺苷对照品的甲醇溶液进行紫外扫描，结果(见图2)发现：马钱苷在236.19 nm波长处有最大吸收，莫诺苷在238.42 nm波长处有最大吸收。因此，尝试对检测条件进行优化，采用237 nm的单波长进行检测。

图2 马钱苷和莫诺苷的紫外吸收图

我们分别尝试采用文献报道中的磷酸-甲醇-水、乙腈-水，以及不同比例的甲醇-水作为流动相，对样品组分的分离情况进行考察。发现流动相中加入酸后，出现峰不对称现象。因此，考虑采用甲醇-水为流动相。在保证样品中莫诺苷和马钱苷组分色谱峰的分离度及峰纯度的情况下，采用梯度洗脱，从而缩短了样品的分析时间，在最大程度上简化了山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量测定方法。

3.2 提取方法的选择

马钱苷和莫诺苷为环烯醚萜苷类化合物，化学性质活泼，易水解，因此对提取条件要求较严格。我们通过对山茱萸的提取溶剂、提取方式和时间及料液比等进行了考察，经过正交试验，考虑到样品中莫诺苷和马钱苷的色谱峰形，最终确定以甲醇为提取溶剂，采用超声提取。提取时间1 h，料液比1∶30。这样既有效地保护了被测成分，又可以使样品组分很好地分离，且峰形较好，故采用甲醇为提取溶剂。

结果显示，我们的测定方法线性关系良好、精密度和准确度高、重复性较好，在最大程度上优化了山茱萸中莫诺苷和马钱苷的含量测定方法，为山茱萸的质量控制提供了简便、快速的含量测定方法。

[1] 李雅梅,李华,李春荣． 山茱萸化学成分及其药理作用研究进展[J]． 武警医学院学报, 2010, 19(6):500-502.

[2] Wang Yue, Li Zhengquan, Chen Lirong, et al. Antiviral compounds and one new iridoid glycoside from Comus officinalis[J]. Progress in natural science, 2006,16(2):142-146.

[3] 胡荣,陈小虎,邓君,等． RP-HPLC-ELSD同时测定山茱萸中马钱苷、齐墩果酸与熊果酸的含量[J]． 中药材, 2010, 33(1):70-71.

[4] 赵永席,马国营,梁恒． 中药山茱萸的高效液相色谱指纹图谱及其聚类分析[J]． 西安交通大学学报, 2006, 40(2):239-242.

[5] 皮文霞,许桂玲,郭戎,等． 山茱萸HPLC指纹图谱研究[J]． 中药材, 2010, 33(4):530-532.

[6] 刘华亮,袁珂,陈年者,等． 山茱萸炮制前后的HPLC指纹图谱研究[J]． 中国药房,2012,23(3):234-236.

[7] 龚卫红,赵希贤. 双波长高效液相色谱法测定山茱萸中多种成分的含量[J]. 中国实验方剂学杂志,2010,16(14):58-60.

[8] 赵平,闫润红,刘养清,等. 栽培与野生山茱萸中马钱苷和莫诺苷含量分析[J]. 中国实验方剂学杂志,2009,15(4):7-9.

[9] 王秀文,刘养清,闫润红,等. 山茱萸中莫诺苷和马钱苷的相关性研究[J]. 现代中药研究与实践,2009,22(6):65-67.

[责任编辑 段金卯]

Determination of the Morroniside and Loganin in Cornus officinalis by HPLC

Institute of Materia Medica, Henan University, Kaifeng 475004, China

〔Objective〕To establish a method for the determination of morroniside and loganin in Cornus officinalis.〔Methods〕The sample was analyzed on a Hypersil-ODS chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), with a gradient elution of methanol-water at the flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 237 nm. 〔Results〕The calibration curves were linear within the range of 0.099 0～0.495 mg/mL for morroniside, and 0.040 0～0.240 mg/mL for loganin, respectively. The average recoveries of morroniside and loganin acid were 97.4% and 98.6%，and RSDs were 1.68% and 1.30%，respectively.〔Conclusion〕It showed that the HPLC method for determination of morroniside and loganin in Cornus officinalis has the following advantages: good linearity, high accuracy, good stability and good reproducibility. It was very significant for the quality control of the drug.

HPLC; Cornus officinalis; Morroniside; Loganin; Content determination

1672-7606(2016)04-0249-03

2016-10-09

基金项目：NSFC-河南人才培养联合基金(U1304826)

李佳(1990-)，女，河南驻马店人，硕士研究生，从事药物新剂型及其质量研究工作。

蒲晓辉(1980-)，男，河南商丘人，博士，副教授，从事药物新剂型研究工作。

R927.2

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