HPLC法测定千里光总黄酮中金丝桃苷在大鼠体内的血药浓度及药动学研究

聂丽云，曹

江苏吉贝尔药业股份有限公司，江苏 镇江，212009

HPLC法测定千里光总黄酮中金丝桃苷在大鼠体内的血药浓度及药动学研究

江苏吉贝尔药业股份有限公司，江苏 镇江，212009

〔目的〕 建立高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)测定千里光总黄酮中金丝桃苷在大鼠体内的血药浓度，并探讨其在大鼠体内药动学特征。〔方法〕 SD大鼠给予千里光总黄酮灌胃，在不同时间点眼眶后静脉丛取血，预处理后测定血浆中金丝桃苷的浓度，用3P97软件处理数据。〔结果〕 千里光总黄酮中金丝桃苷在大鼠体内的药动学符合二房室模型，金丝桃苷在体内较快地被吸收，给药后1 h即达到峰浓度，Cmax=(0.922±0.182)mg/L，其他主要药动学参数Ka=(2.754±0.382)/h、α=(1.421±0.275)/h、β=(0.238±0.083)/h、t1/2β=(11.084±5.962)h、AUC0-24=(9.271±2.357)mg·h·L-1)。〔结论〕高效液相色谱法测定血浆中金丝桃苷浓度准确、简便，适用于千里光总黄酮中金丝桃苷的药动学研究。

金丝桃苷；千里光总黄酮；药动学；高效液相色谱法

千里光(Senecionis Scandentis Herba)为菊科植物千里光(Senecio scandens Buch.-Ham.)的干燥地上部分，性苦、寒，归肺、肝经，具有清热解毒、明目、利湿之功效，主要用于治疗痈肿疮毒、感冒发热、目赤肿痛、泄泻痢疾、皮肤湿疹等[1]。千里光中富含生物碱类、酚酸类、黄酮类、挥发油类和萜类等化学成分，黄酮类成分是千里光中的主要化学成分[2]。现代药理研究表明，千里光总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等药理作用[3-5]。金丝桃苷是千里光总黄酮的指标性成分，但有关千里光总黄酮中金丝桃苷的药动学研究尚未见相关报道。我们通过研究灌胃给予千里光总黄酮后金丝桃苷在大鼠体内的药动学过程，旨在揭示其在动物体内的动态变化特征，为研究开发新型中药制剂及功能保健食品等提供参考。

1 实验器材与方法

1.1 仪器与材料

雄性SD大鼠(清洁级，购于江苏大学动物实验中心，合格证号：SCXK(苏)2013-0011)，5只，每只体质量250 g左右。

仪器：高效液相色谱仪系统(岛津LC-20A、SPD-20A紫外检测器及N2000色谱工作站)，高速冷冻离心机(美国Sigma公司)，快速混匀器(江苏金坛中大仪器厂)，赛多利斯AL204分析天平(赛多利斯公司)，微量移液器(中国大龙仪器公司)，BuchiR-200旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)，HH系列数显恒温水浴锅(江苏金坛医疗仪器厂)，冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)。

材料：金丝桃苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111521-201507)，千里光总黄酮(自制，HPLC法测得金丝桃苷含量为5.375 mg/g)，乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)，注射用水(公司自制)。其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱，Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相， 体积配比为23∶77的乙腈、体积分数为0.2%的醋酸水溶液；流速1 mL/min，紫外检测波长360 nm，柱温35 ℃，进样20 μL。

1.2.2 千里光总黄酮的制备 称取干燥的千里光适量，粉碎，过40目筛；置烧瓶中，用12倍量体积分数为80%的乙醇加热回流提取3次，每次2 h；过滤，滤渣用体积分数为80%的乙醇润洗；合并滤液，浓缩，除乙醇并冷冻干燥。经HPLC检测，提取物中金丝桃苷含量为5.375 mg/g。

1.2.3 对照品溶液的配制 称取经P2O5干燥过夜的金丝桃苷对照品适量，置100 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，制得含金丝桃苷58.8 mg/L的对照品溶液。

1.2.4 血浆样品预处理 大鼠眼眶后静脉丛取血0.5 mL，置于已肝素化的离心管中，12 000 r/min高速离心3 min，分离得血浆。精密吸取血浆0.1 mL，加0.2 mL乙腈沉淀蛋白，涡流振荡1 min，12 000 r/min高速离心3 min；取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 方法的专属性 将空白血浆、空白血浆中加入金丝桃苷对照品、灌胃千里光总黄酮血浆样品在1.2.1节所述色谱条件下进样，考察金丝桃苷主峰的特异性，以及与内源性物质的分离度是否良好。

1.2.5.2 线性范围及检测限 吸取金丝桃苷对照品溶液适量，置于1 mL离心管中，加入大鼠空白血浆100 μL，配制成金丝桃苷含量分别为0.058 8、0.1470、0.294、0.588、1.470、2.940、5.880 mg/L的血浆样本；进行色谱分析，以峰面积A对血药浓度C进行线性回归，以信噪比为3时的金丝桃苷浓度为检测限。

1.2.5.3 精密度 配制金丝桃苷含量为0.147、0.588、2.940 mg/L的低、中、高浓度血浆样品，按1.2.4节所述方法处理。处理后进样分析，低、中、高浓度样品各测5次，连续测定3 d，测定金丝桃苷的含量，检验计算方法的精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制金丝桃苷含量为0.147、0.588、2.940 mg/L的低、中、高浓度血浆样品各5份，进样20 μL，测得峰面积(5次测定的平均值)A1。以同时配制等浓度的对照品溶液进样，测得的峰面积(5次测定的平均值)A2，作为对照。由R=(A1/A2)×100%，分别计算低、中、高浓度的血浆样品中金丝桃苷的提取回收率。

1.2.5.5 稳定性考察 配制金丝桃苷含量为0.147、0.588、2.940 mg/L的低、中、高浓度血浆样品。室温25 ℃、预处理后样品室内温度4 ℃，考察反复冻融及长期冷冻(-70 ℃)下的样品稳定性。

1.2.6 药动学研究 大鼠给药前禁食不禁水，给予千里光总黄酮6 g/kg(给药剂量按金丝桃苷算，约为32.25 mg/kg)灌胃。以体积分数为1%的CMC-Na制成混悬液，灌胃。并于给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h行眼眶后静脉丛取血，置于肝素化离心管中，分离血浆，-20℃保存。

2 结果

2.1 方法的专属性

空白血浆、空白血浆中加入金丝桃苷对照品、灌胃千里光总黄酮血浆样品色谱图见图1。金丝桃苷与其他干扰组分分离效果良好，无杂质峰干扰。

图1 大鼠血浆样品中金丝桃苷的HPLC色谱图

浓度/(mg·L-1)日内精密度测量值/(mg·L-1)准确度/%RSD/%日间精密度测量值/(mg·L-1)准确度/%RSD/%0．1470．142±0．00396．602．110．141±0．00595．923．550．5880．576±0．01497．962．430．566±0．01696．262．832．9402．883±0．07198．062．462．871±0．07997．652．75

2.2 线性范围及检测限

线性方程为A=7 815.4 C+735.4(r2=0.999 8)，血浆中金丝桃苷的含量在0.058 8～5.880 mg/L之间，线性关系良好。金丝桃苷的检测限为0.018 7 mg/L。

2.3 精密度

该检测方法的精密度结果见表1。

2.4 提取回收率

低、中、高浓度的血浆样品中，金丝桃苷的提取回收率分别为85.2%、83.7%、84.6%，平均提取回收率为84.5%，符合药动学实验要求。

2.5 稳定性考察

低、中、高浓度的血浆样品在室温(25 ℃)放置24 h，预处理后样品室内(4 ℃)放置3 d。反复冻融3次及-70 ℃冷冻储藏1 mon，均有良好稳定性。

2.6 药动学结果

采用3P97药动学程序对血药浓度数据拟合计算。结果表明，千里光总黄酮中的金丝桃苷在大鼠体内的药动学符合二房室模型，主要的药动学参数见表2，其平均药-时曲线见图2。

表2 金丝桃苷在大鼠体内的主要药动学参数

图2 金丝桃苷在大鼠体内的药-时曲线

3 讨论

3.1 血浆预处理考

通过预实验研究发现，固相萃取法提取回收率较低，且操作较蛋白沉淀法繁琐，所以采用有机溶剂蛋白沉淀法。分别考察了甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸等有机溶剂，通过综合比较杂质干扰及提取回收率因素，发现乙腈沉淀蛋白效果最好。同时考察了不同体积比的血浆-乙腈(1∶2，1∶3，1∶4)对金丝桃苷测定的影响，结果发现当血浆、乙腈的体积比为1∶2时较为合适。故以体积比为1∶2的血浆-乙腈作为沉淀蛋白条件。

3.2 色谱条件的考察

在千里光药材金丝桃苷测定的色谱条件基础上，对流动相比例进行调整，以排除内源性物质对其测定的干扰。结果表明，当乙腈与体积分数0.2%醋酸水溶液的体积比为23∶77时，血浆样品中的金丝桃苷分离度较好，内源性成分无干扰，保留时间适宜。

3.3 药动学特征研究

研究发现，大鼠灌胃千里光总黄酮后，金丝桃苷在其体内药动学过程符合二房室模型。吸收速率常数Ka=(2.754±0.382)/h，表明金丝桃苷在胃肠道能较快地被吸收。灌胃后血浆中的金丝桃苷在1 h即达峰值Cmax=(0.922±0.182)mg/L，且分布速率常数α=(1.421±0.275)/h，表明金丝桃苷进入大鼠体循环后能迅速地分布，从而迅速发挥药效。另外，通过消除速率常数β=(0.238±0.083)/h和消除半衰期t1/2β=(11.084±5.962)h，表明金丝桃苷在体循环中消除较慢。综上所述，金丝桃苷在体内能迅速吸收分布发挥作用，且持续时间较长，更提示在开发新型中药制剂或保健食品时应合理设计服用间隔时间。

3.4 双峰现象的考察

研究中还发现，金丝桃苷在大鼠体内6 h时有二次吸收峰。有文献[6]报道，某些药物因肝肠循环在体内可出现二次吸收峰，而此重吸收过程有可能是导致金丝桃苷在体内消除相半衰期(t1/2β)长的原因。由于我们的研究对象为千里光总黄酮，是一系列黄酮类化合物的混合物，所以不能排除同类的苷类黄酮化合物在体内代谢转化为金丝桃苷被吸收进入体循环，而且各个化学成分之间的相互作用都有可能导致金丝桃苷的吸收、分布及代谢等发生变化，其具体机制有待进一步的深入研究。

我们在实验中建立的方法的日内和日间精密度、回收率与稳定性均符合药动学要求，适用金丝桃苷的体内分析及药动学研究。研究结果为千里光的新型中药制剂、保健食品的开发提供了实验基础，有利于后期进一步的开发研究。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典·一部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2015:33-34.

[2] 徐定平，周鑫堂，郜红利，等. 千里光化学成分和药理作用研究进展[J]. 中国药师，2014,17(9):1562-1565.

[3] 张文平，陈惠群，张文书，等. 千里光总黄酮的抗炎作用研究[J]. 时珍国医国药，2008,19(3):605-607.

[4] 陆艳丽，管毓相，方玉梅. 千里光黄酮类化合物清除DPPH自由基的作用[J]. 食品科技，2010,35(3):197-199.

[5] 何忠梅，白冰，王慧，等. 千里光总黄酮体外抗肿瘤和抗病毒活性研究[J]. 中成药，2010,32(12):2045-2047.

[6] 梁文权. 生物药剂学与药物动力学[M]. 2版. 北京:人民卫生出版社,2003:150-151.

[责任编辑 段金卯]

Plasma concentration of hyperoside in total Flavonoids of Senecionis scandens Herba in rats by HPLC and its pharmacokinetics study

Jiangsu Jibrier Pharmaceutical Joint Stock Limited Liability Company, Zhenjiang 212009, China

〔Objective〕To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for measuring the concentration of hyperoside in total flavonoids of Senecionis scandens Herba in rats and the pharmacokinetics of which was also detected.〔Methods〕After oral administration of total flavonoids of Senecionis scandens Herba ,blood sample were collected through venous plexus in rat eye at different time. After liquide extraction with acetonitrile, the concentration of hyperoside in plasma was measured. Then pharmacokinetics parameters were calculated with 3P97 program.〔Results〕The result showed that hyperoside plasma concentration-time curves in rats coincided with two-compartment model, hyperoside was absorbed fast in rats. Cmaxof hyperoside in rat plasma was (0.922±0.182) mg/L at one hour. The main pharmacokinetic parameters were composed of: Kawas(2.754±0.382)/h, α was(1.421±0.275)/h, β was(0.238±0.083)/h, t1/2βwas (11.084±5.962) h, AUC0-24was (9.271±2.357) mg·h·L-1.〔Conclusion〕HPLC method is accurate and sensitive, and is suitable for the pharmacokinetic study of hyperoside in total flavonoids of Senecionis scandens Herba in rats.

hyperoside; total flavonoids of Senecionis scandens Herba; pharmacokinetics; HPLC

1672-7606(2016)04-0252-04

2016-09-15

聂丽云(1984-)，女，江苏金坛人，执业药师，工程师，从事药动学研究工作。

曹旭(1988-)，男，江苏扬州人，硕士，工程师，从事药动学研究工作。

R969.1

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