野生大孔多孔菌的分离鉴定及生物学特性1)

卢孟召 王世伟 徐济责

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101) (长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室)



野生大孔多孔菌的分离鉴定及生物学特性1)

卢孟召 王世伟 徐济责

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101) (长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室)

为充分开发利用大孔多孔菌资源，通过对左家保护区的野生大孔多孔菌进行传统形态学与分子生物学鉴定相结合的方法，并对其菌丝体的生物学特性从pH值、单色光(昼夜交替)、氮源、无机盐、碳源、温度等影响因素进行了单因素试验和正交试验。系统研究结果表明：该种与大孔多孔菌相似度100%；菌丝体最适培养条件在蓝光(昼夜交替)、30 ℃下培养，最适无机盐为硫酸镁、最适氮源为牛肉膏、最适碳源为淀粉、pH为5.0。

白腐菌；ITS鉴定；形态学鉴定

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：76-79.

For the exploitation and utilization the resource ofPolyporusalveoaris, traditional morphological and molecular biological method were used to identify the wildP.alveoariswhich was collected from Zuojia Protection Zone. The biological characteristics of its vegetative mycelium was investigated by single factor test and orthogonal test, including the optimal pH, light, nitrogen source, inorganic salt, carbon source and temperature. The results showed that this wild strain 100% similarity as recordsP.alveoaris. The optimal growth conditions are blue light (day and night alternating), 30 ℃, MgSO4as inorganic salt, beef extract as the nitrogen source, starch as the carbon source, and pH of 5.

大孔多孔菌[Polyporusalveolaris(DC.:Fr.) Bond. & Sing.]隶属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌属(Polyporus)。引起木材白色腐朽[1-2]是一种重要的森林病原真菌[3]。但其子实体内含有的多糖、多肽类等物质具有一定的抗细菌生长能力。Wang H et al[4]，从大孔多孔菌子实体中提取一种新型抗真菌多肽(alveolarin)，对灰葡萄孢菌、尖孢镰刀菌、花生球腔菌等的菌丝生长表现出抑制作用。郭永霞等[5]，研究表明大孔多孔菌的抗真菌蛋白alveolarin由两个分子量为14 kDa的亚基组成。Barrasa et al[6]，发现大孔多孔菌对染料具有一定的脱色作用。当前关于大孔多孔菌的相关研究所材料均为其子实体，其子实体主要来源为野外采集，但此方式获取的生物量难以满足更多科学研究需要。且关于大孔多孔菌菌丝体相关研究又欠缺。因此，本研究从大孔多孔菌菌丝体的生物学特性及其鉴定等相关方面开展研究，为其森林病害的防治、子实体的栽培驯化、菌丝体的充分开发和利用提供基础数据，为探索大孔多孔菌的遗传多样性及真菌区系多样性研究提供参考。

1 材料与方法

供试菌株采集于左家自然保护区(菌株编号为4659)。

PDA加富培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨4 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，纯净水1 000 mL，pH自然。

子实体形态鉴定与菌种制备：根据采集到的子实体，进行宏观和微观形态学特征描述与鉴定。菌种制备采用组织分离法，得到的纯菌种在恒温培养箱中25 ℃培养至5 d后，4 ℃保藏备用。

菌丝体DNA的提取：采用试剂盒(艾德莱生物科技有限公司)提取菌丝体DNA。

ITS片段的PCR扩增：PCR扩增的引物为ITS1:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGC3′和ITS4:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′[7]。50 μL反应体系，模板10 μL，ITS1引物(10 μmol/L)1 μL，ITS4引物(10 μmol/L)1 μL，10×PCR缓冲液(10 mmol/L)5 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，dNTP 1 μL，剩余体积用ddH2O补足。PCR反应参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，53 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s，45个循环,后延伸72 ℃ 10 min反应结束后取PCR产物5 μL，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。

ITS序列测定：PCR产物纯化后送北京华大基因完成测序。

构建发育树：测序结果于GenBank数据库中进行Blast比对，选取代表性序列做进一步分析，用MEGA5.0进行系统发育分析，并以邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树[8]。

pH试验：用1 mol/L的HCL和1 mol/L的NaOH调PDA加富培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 5个处理。无菌条件下接种5 mm直径的菌饼，每个处理5个重复；25 ℃避光培养，观察并记录菌丝长势、粗壮程度、疏密程度、菌落边缘整齐度、菌落颜色等。培养7 d后，采用十字交叉法测量菌落直径。运用SPSS 19.0进行数据分析。

单色光试验(昼夜交替)：用白光、紫光、蓝光、黄光、红光、绿光作为单色光因素。接种、培养条件、观测指标同pH试验。

氮源试验：用蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、尿素、硝酸铵五种氮源，等量代替PDA加富培养基中的蛋白胨。接种、培养条件、观测指标同pH试验。

无机盐试验：用硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、硫酸铜、硫酸钙五种无机盐，等量代替PDA加富培养基中的硫酸镁。接种、培养条件、观测指标同pH试验。

碳源试验：供试碳源选取葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、乳糖7种，等量代替PDA加富培养基中的葡萄糖。接种、培养条件、观测指标同pH试验。

温度试验：分别设置15、20、25、30、35 ℃ 5个温度处理培养大孔多孔菌菌丝体。接种、观测指标同pH试验。

正交试验：在以上6个试验之后，进行六因素两水平正交试验，试验设计L8(26)如表1，筛选pH、单色光(昼夜交替)、氮源、无机盐、碳源、温度的最优组合。

表1 最优培养基组合筛选正交试验设计

2 结果及分析

2.1 子实体宏观和微观形态特征描述与鉴定

柄偏生或短侧生，韧肉质。菌盖肾形、扇形、略圆形或近漏斗形，近基部往往下凹，直径3～6 cm，厚2.5～10.0 mm，表面有纤毛组成的小鳞片，无环纹或有不明显的环纹；边缘薄，有时内卷。菌肉近白色，后变浅黄色，土黄色，干后硬而脆，厚1～4 mm。菌管近白色或浅黄色，长2～5 mm。孔面与菌管同色；管口菱形，辐射状排列，长1～5 mm，宽0.5～1.5 mm，管口缘有时呈锯齿状。菌柄短小，颜色与菌管相似，质地同菌盖，长0.5～7.5 cm，粗0.5～1.0 cm。担孢子圆柱形，透明，平滑，(8～11)μm×(2.4～4.0)μm。如图1。

A、B.4659菌株生态照；C.4659菌丝；D.4659孢子；E.4659担子。

2.2 分子鉴定

电泳结果：凝胶成像仪观察4659菌株电泳结果(如图2)。

图2 扩增产物电泳图谱(1.4659菌株PCR产物；M.Marker)

系统发育树：进行序列比对后，构建发育树。如图3。经典的形态学鉴定与分子水平鉴定结合，最终菌株4659鉴定为大孔多孔菌(Polyporusalveoaris)。

2.3 pH对大孔多孔菌菌丝体生长的影响

pH对菌丝体生长的影响如表2。菌丝体在pH值为5.0～9.0均能生长，酸性环境下菌丝体的长势较好，在pH值为5.0时，菌丝体的生长状态最佳，日均长速达7.106 4 mm。当pH值大于5.0，菌丝体的日均长速有减弱的趋势，并且菌丝体的粗壮度有明显的变化。因此，菌丝体在pH值为5.0～9.0的培养基中，最适生长pH值在5.0左右。分析其原因可能与大孔多孔菌的生长环境有关。

图3 基于rDNA-ITS的系统发育树

pH值菌丝粗壮度颜色边缘整齐度气生菌丝疏密程度长势日均长势/mm5．0+++乳白色整 齐+++++7．1064a6．0+++乳白色不整齐++++6．3872a7．0++乳白色整 齐++4．0227c8．0++乳白色整 齐+++5．3392b9．0++乳白色不整齐++4．3384c

注：+++ 粗壮、长势良好；++ 较粗壮、长势较好；+密、长势好；同列不同小字母表示差异显著。

2.4 单色光对大孔多孔菌菌丝体生长的影响(昼夜交替)

单色光对菌丝体生长的影响如表3。菌丝体对单色光的利用具有较显著差异。菌丝体在不同单色光作用下的效果也有所不同。其中在红光作用下，菌丝体的综合指标较好，日均长速达9.040 0 mm；蓝光、紫光次之；绿光、黄光对菌丝体表现出较强的抑制作用。试验表明，部分单色光对菌丝体具有一定的刺激作用，其中红光(昼夜交替)为最佳。

表3 大孔多孔菌菌丝体在不同单色光下的生长状况(昼夜交替)

单色光菌丝粗壮度颜色边缘整齐度气生菌丝疏密程度长势日均长势/mm紫光++白 色整齐+++1．3000bc蓝光++灰白色整齐+++1．6125b红光++乳白色整齐+++++9．0400a绿光------黄光------

注：+++ 粗壮、长势良好；++ 较粗壮、长势较好；+密、长势好；同列不同小字母表示差异显著。

2.5 氮源对大孔多孔菌菌丝体长的影响

氮源对菌丝体生长的影响如表4。大孔多孔菌除尿素外的其他4种氮源下均能生长。酵母浸膏为氮源时，长势良好，日均长速达8.501 1 mm，优于牛肉膏，硝酸铵次之，之后为蛋白胨。其中酵母浸膏、牛肉膏为氮源时，菌落颜色呈乳白色，菌落边缘整齐。蛋白胨、硝酸铵为氮源时，菌落颜色呈白色，菌落边缘不整齐。综合认为供试菌菌丝体的最适生长氮源为酵母浸液，其次是牛肉膏。

表4 大孔多孔菌菌丝体在不同氮源下的生长状况

注：+++ 粗壮、长势良好；++较粗壮、长势较好；+密、长势好；-不生长；同列不同小字母表示差异显著。

2.6 无机盐对大孔多孔菌菌丝体生长的影响

无机盐对菌丝体生长的影响如表5。在不同无机盐培养基上菌丝体生长速度具有显著性差异。最适无机盐为硫酸铁，日均长速可达2.286 7 mm。其中硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰对菌丝体的长势均有利，菌落边缘整齐，菌丝粗壮，颜色为乳白色。而硫酸铜、硫酸钙对菌丝的作用不显著，且菌落边缘不整齐，菌丝纤细。

表5 大孔多孔菌菌丝体在不同无机盐下的生长状况

注：+++ 粗壮、长势良好；++浓密、长势较好；+纤细、密、长势好；同列不同小字母表示差异显著。

2.7 碳源对大孔多孔菌菌丝体生长的影响

碳源对菌丝体生长的影响如表6。由表可知菌丝体在以蔗糖为碳源的培养基上生长迅速，长势最好，日均长速达8.630 0 mm。菌丝体对单糖没有较强的选择性，而在乳糖为碳源的培养基上菌丝稀疏、纤弱、不整齐，抑制菌丝体的生长。

表6 大孔多孔菌菌丝体在不同碳源下的生长状况

注：+++ 粗壮、长势良好;++ 壮、长势较好；+浓密、长势好；-密；同列不同小字母表示差异显著。

2.8 温度对大孔多孔菌菌丝体生长的影响

温度对菌丝体生长的影响如表7。菌丝体在以下温度下均能生长，当温度在30 ℃时，生长速度达到最大，之后随着温度的上升，菌丝体的生长速度逐渐减弱。菌丝体的最适生长温度在30 ℃，当温度为30 ℃时，菌丝体日均长速为6.715 2 mm,长势较好。

表7 大孔多孔菌菌丝体在不同温度下的生长状况

注：+++ 粗壮、长势良好;++ 较粗壮、浓密、长势较好；+密、长势好；同列不同小字母表示差异显著。

2.9 正交试验分析

正交试验数据分析表明，对大孔多孔菌菌丝体生长的影响因素由大到小顺序为单色光、氮源、无机盐、温度、pH、碳源，通过正交试验极差分析可知：氮源对菌丝体生长影响最大，单色光对菌丝体生长最小。菌丝体生长的最优组合为：蓝光(昼夜交替)、牛肉膏、硫酸镁、30 ℃、pH=5.0、淀粉。

3 结论与讨论

对大孔多孔菌生物学特性的研究得出以下结论：该菌株的菌丝生体长最适pH为5.0，大孔多孔菌和多数大型真菌一样喜欢中性偏酸环境下生长；大孔多孔菌菌丝体生长阶段最适单色光质为红光昼夜交替，与朱峥等[9]对左家保护区的野生紫丁香蘑生物学特性研究和朱坚等[10]的不同颜色薄膜套袋对金针菇生长发育的影响相一致，红色光质对，在诱导子实体发生阶段。关于红光在大型真菌菌丝体生长中的促生机制有待于深入研究；大孔多孔菌菌丝体生长最适氮源为酵母浸膏，在尿素作为氮源的培养基上我不能生长或萌发初期即菌丝枯黄萎缩等情况，分析几种氮源在被微生物利用的分子水平上发现：尿素在高温条件下即超过60 ℃既可以发生水解，且随温度升高，水解更加剧烈，本研究培养基灭菌条件为121 ℃，20 min。在此条件下尿素会快速水解为NH3和CO2，且NH3又极易溶于水，而释放出大量OH-而使整个基质呈弱碱性，而不利于菌丝体生长。在无机盐利用上，大孔多孔菌菌丝体和其他大型真菌相似在硫酸镁和硫酸铁的利用上更优于其他无机盐，关于这方面的结论在朱峥等[9]等诸多文献均以Mg2+作为酶的活性中心而进行分析。大多数大型真菌在碳源选择上以葡萄糖为最优，但在本研究中蔗糖为大孔多孔菌的最佳碳源。根据温度试验研究结果显示30 ℃条件下大孔多孔菌的菌丝体长势最优，长速最快，通过分析该菌株采集时间及气候条件分析，确定大孔多孔菌的温型为中高温型。

综合以上研究，大孔多孔菌菌丝体在30 ℃时生长最快，因此，在北方野生大孔多孔菌大都发生在夏季；且与多数大型真菌一样适合在中性偏酸环境下生长；给予蓝光刺激有利于菌丝体的生长。通过正交试验，确定最优组合，为其森林防护、子实体的栽培驯化、菌丝体的充分开发和利用提供基础数据，为探索大孔多孔菌的遗传多样性及真菌区系多样性研究提供参考。

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WildPolyporusalveolarisSeparate Isolation and Identification of Biological Characteristics

Lu Mengzhao, Wang Shiwei

(Jilin Agriculture Technology and Science College, Jilin 132101, P. R. China)； Xu Jize(Key Labratory of Changbai Mountain Animal and Plant Rescources' Utilization and Protection of Univer)

White rot fungi; Internal transcript spacer (ITS) identification; Morphological identification

1)吉林农业科技学院微生物重点学科资助项目；吉林农业科技学院大学生创新项目(吉农合字(2015)第039号)；吉林省酿造技术科技创新中心项目；国家级大学生科技创新项目(201611439017)；吉林省大学生科技创新项目(吉农合字(2016)第050号)。

卢孟召，男，1995年9月生，吉林农业科技学院生物工程学院，本科生。E-mail：1134674900@qq.com。

徐济责，吉林农业科技学院生物工程学院，讲师；长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，讲师；吉林省酿造技术科技创新中心，讲师。E-mail：xujize@163.com。

2016年4月20日。

S646.2；Q934.1

责任编辑：潘 华。