五味子药渣多糖的提取及其免疫活性1)

郭志欣 朱俊义 顾地周 孙弋博 崔悦 宋慧

(通化师范学院，通化，1340022)(吉林农业大学)



五味子药渣多糖的提取及其免疫活性1)

郭志欣 朱俊义 顾地周 孙弋博 崔悦 宋慧

(通化师范学院，通化，1340022)(吉林农业大学)

提取并纯化得到五味子药渣多糖，对其体外免疫活性进行初步评价。经水提醇沉、乙醇分级、活性碳脱色、Sevage法和链蛋白酶联合脱蛋白，从五味子药渣中获得cSDP、fSDP和SDP 3种多糖。通过体外淋巴细胞转化试验验证3种多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，结果表明：3种五味子药渣多糖在一定质量浓度下对未经活化的小鼠淋巴细胞有增殖作用,对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖有显著促进作用；多糖的纯化程度越高对小鼠脾淋巴细胞的增殖促进作用越强；五味子药渣粗多糖中的蛋白对小鼠脾淋巴细胞的增殖没有影响。

五味子；药渣；多糖；纯化；淋巴细胞转化

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：80-82.

We extracted and purified the polysaccharides from dregs ofSchisandrachinensis(Turcz.) Bailey to discuss the effects of polysaccharides on lympgocyte transformation of mice spleen lymphocyte. The polysaccharides (cSDP, fSDP and SDP) were extracted and isolated from dregs ofS.chinensisby alcohol precipitation method, decoloration and deproteinization. We studied the lymphocyte transformation in vitro of the three kinds of polysaccharides. The three kinds of polysaccharides had effects under a certain concentration and significant promotion effects on the lymphocyte proliferation of mice spleen activated by ConA. Polysaccharides with high purification degree could promote the proliferation of mice spleen lymphocyte. The protein in the crude polysaccharides from dregs ofS.chinensishad no effects on the proliferation of mice spleen lymphocyte.

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Bailey)是五味子科，五味子属多年生藤本植物。果实入药，主治咳喘、自汗、盗汗、遗精、久泻、神经衰弱、健忘失眠等症[1]。目前，制药企业主要通过回流方式获得其脂溶性成分入药，剩余药渣被焚烧或丢弃，这既对环境造成了污染，又是一种资源浪费[2]，实际上被废弃的药渣中还存在多糖等多种活性成分[3]。近几十年来，越来越多的研究发现，多糖及糖复合物在生物体中不仅是作为结构和能源物质，更重要的是与细胞的生命活动和多种多样的生物学功能密切相关。多糖类物质是许多中草药的主要免疫活性物质,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等多种功能，其应用范围日益扩大，逐渐被用于多糖类保健食品的开发。现代药理学研究表明，五味子多糖不仅具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗氧化等多种生物学活性[4-5]，还具有预防和治疗癌症的潜在价值[6-7]。若将五味子药渣中多糖充分利用[8]，既可以避免环境污染，又会带来较高的经济价值。本文研究了五味子药渣多糖cSDP，fSDP和SDP在体外对小鼠脾淋巴细胞免疫功能的调节作用，确定五味子药渣多糖的质量浓度、纯化程度以及粗多糖中的蛋白在体外对淋巴细胞免疫调节功能的影响，为五味子药渣多糖的免疫调节机制，及相关药品及保健食品的开发提供依据。

1 材料与方法

五味子药渣为护肝片生产后五味子残渣，由修正药业提供；试验所用小白鼠购于吉林长春高新开发区；试剂RPMII 1640培养液、ConA(刀豆素A)为Sigma公司产品，二甲基亚砜为北京化学试剂公司产品，其余试剂均为分析纯；6010型紫外分光光度计，754可见光分光光度计，CO2培养箱，96孔细胞培养板，酶联免疫检测仪等。

1.1 五味子药渣多糖的提取和纯化

粗多糖的提取：取五味子药渣1 000 g，加入30 L水，100 ℃提取2 h，收集3次提取液进行过滤，滤液浓缩后加入0.1%的活性炭脱色，再加入3倍体积95%乙醇，4 ℃过夜，离心取沉淀，常规干燥，即得五味子药渣水溶性粗多糖cSDP。

冻融：将5%粗多糖溶液冷冻过夜(-20 ℃)，室温融化，离心20 min(8 000 r/min，4 ℃)，除去少量沉淀。该过程重复数次，直至无沉淀为止。

乙醇分级：将冻融后的粗多糖溶液加无水乙醇，使乙醇终体积分数达30%，4 ℃过夜后离心，常规干燥后获得多糖fSDP。

脱蛋白：采用链蛋白酶和Sevag法联合脱蛋白[9-10]。将fSDP配制为5%的糖溶液，糖液中加入链蛋白酶(m酶∶m蛋白=1∶200)，加入二甲苯防腐，37 ℃，保温24 h，糖液总体积1/4加入Sevag试剂，摇床振荡2 h后离心，取上清重复操作，直至无游离蛋白为止，常规干燥即得五味子药渣纯化多糖SDP。

1.2 五味子药渣多糖量的测定

采用苯酚—硫酸法[11]测糖量。将0.1 g/L的糖溶液、6%的苯酚溶液、浓H2SO4按体积比1.0∶0.5∶2.5依次加入试管，振荡，静止，冷却，在490 nm波长下测光密度值，查标准曲线即得糖量。

1.3 小鼠脾淋巴细胞的转化

采用MTT法[12-16]，将小鼠用颈椎脱臼法处死，用75%的酒精浸泡消毒(约15 min)，无菌条件下解剖小鼠。沿腹腔中线剪开小鼠胸腔，取出脾，用剪刀剔除结缔组织和脂肪后将其剪碎，加入3 mL 1640培养液,用匀浆器研磨脾组织，制成脾细胞液。将脾细胞液置于盛有Hanks液的平皿内，用纱布过滤，吸取Hanks液冲洗纱布。将悬液离心(1 500 r/min，5 min)，用0.01 mol/L Tris-NH4Cl低渗裂解红细胞1 min后，弃上清液，用Hanks液洗涤细胞2次。

取待测的细胞悬液0.1 mL，与Hanks液及0.4%的台盼蓝0.1 mL均匀混合，2～5 min后滴入血球计数板内，于显微镜下按照白细胞计数法观察并计数。

用1640培养液将细胞稀释成一定浓度，制成单细胞悬液。将悬液加入96孔培养板中，每孔0.1 mL。96孔板中分别加入3种不同质量浓度的多糖溶液，将培养板放入含有5% CO2的培养箱，37 ℃培养48～72 h。在培养结束前4～6 h时，向培养板各孔内加入1 g/L MTT液，10 μL/孔，37 ℃培养6 h。然后向各孔内加入酸性异丙醇110 μL，30 min内用酶标测定仪测OD值，测定波长为570 nm。

2 结果与分析

2.1 多糖性质分析

按1.1和1.2中方法对五味子药渣粗多糖进行提取后，通过冻融、乙醇分级、脱蛋白和含量测定等步骤后获得粗多糖cSDP，提取的cSDP为浅棕色粉末，易溶于水，收率为3.56%，糖质量分数为50.39%。纯化多糖SDP为浅黄色粉末，易溶于水，糖质量分数为82.2%。

2.2 淋巴细胞转化

由表1可知：与阴性对照相比，cSDP在质量浓度低于5.00 mg/L时，对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著的促进作用；fSDP、SDP在质量浓度为5.00、10.00 mg/L时，对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著的促进作用，并且在实验的范围内呈现出剂量依赖效应。说明多糖单独作用时，多糖的纯化程度和多糖质量浓度均对其免疫活性存在影响。

表1 cSDP、fSDP和SDP对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

注：表中数据为平均值±标准差；与阴性对照组相比，*表示差异显著(p<0.05)。

由表2可知：与阳性对照组ConA相比，cSDP在质量浓度2.50、5.00 mg/L时，能协同ConA促进小鼠脾淋巴细胞的增殖；fSDP及SDP在质量浓度2.50～10.00 mg/L时，能协同ConA促进小鼠脾淋巴细胞的增殖；fSDP在质量浓度5.00 mg/L时有极显著的促进作用。说明这3种多糖在与ConA协同作用时，其对小鼠淋巴细胞的增殖作用与多糖的纯化程度关系不大，并且在试验范围内，3种多糖质量浓度均在5 mg/L时，对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用最为显著。

表2 cSDP、fSDP和SDP体外协同ConA对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

3种多糖质量浓度/mg·L-1ODcSDPODfSDPODSDP阳性对照0．351±0．0130．351±0．0130．351±0．0131．250．312±0．0250．336±0．0380．353±0．0062．50(0．423±0．001)∗(0．421±0．003)∗(0．416±0．004)∗5．00(0．425±0．020)∗(0．441±0．016)∗∗(0．433±0．004)∗10．000．402±0．083(0．420±0．012)∗(0．418±0．010)∗

注：表中数据为平均值±标准差；与ConA阳性对照组相比，*表示差异显著(p<0.05)，** 表示差异极显著(p<0.01)。

由表3可知：与LPS阳性对照组相比，cSDP、fSDP及SDP在不同质量浓度下，均无显著的促进作用。说明这3种多糖在与LPS协同作用时，对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响不显著。

表3 cSDP、fSDP和SDP体外协同LPS对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

3种多糖质量浓度/mg·L-1ODcSDPODfSDPODSDP阳性对照0．395±0．0390．395±0．0390．395±0．0391．250．372±0．0640．322±0．0390．357±0．0112．500．385±0．0670．302±0．0160．378±0．0035．000．405±0．1650．325±0．0260．348±0．04710．000．446±0．1370．390±0．1760．311±0．068

3 结论与讨论

试验通过醇沉分级、脱色、脱蛋白，从五味子药渣中获得3种多糖，对其体外免疫活性进行了研究。结果表明：cSDP、fSDP和SDP在一定质量浓度下对未经活化的淋巴细胞有增殖作用，对经ConA活化的淋巴细胞增殖有显著促进作用，说明了其有较好的免疫兴奋作用。这一结果与苗明三等[17]对五味子多糖能促进正常小鼠免疫功能的研究结果一致，这说明五味子用于提取护肝片生产的成分，其残渣中仍然含有显著促进淋巴细胞增殖的活性多糖，说明护肝片生产后的五味子药渣存在很高的再利用价值。

研究中发现，五味子药渣多糖的质量浓度以及纯化程度均会影响小鼠脾淋巴细胞免疫的程度。在低质量浓度时，对小鼠脾淋巴细胞免疫无影响；在本试验有效质量浓度范围内，五味子药渣多糖质量浓度为5 mg/L时，在体外促进小鼠脾淋巴细胞转化作用最强。试验中，SDP较cSDP促进小鼠脾淋巴细胞转化的质量浓度范围增大，说明多糖纯化程度越高，对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用越显著。五味子药渣多糖除蛋白前后，对小鼠淋巴细胞转化的促进作用差别不大，说明五味子药渣粗多糖中的蛋白对小鼠脾淋巴细胞的增殖没有影响。目前，未见报道说五味子蛋白具有促进淋巴细胞转化的作用，但王巍等[18]研究的免疫调节肽对淋巴细胞转化有促进作用，说明五味子蛋白和免疫调节肽的结构从本质上是不同的。本研究结果为护肝片生产后的五味子药渣再利用和深度开发提供了理论基础。

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Extraction and Immunological Activity of Polysaccharide from Dregs ofSchisandrachinensis(Turcz.) Bailey

Guo Zhixin, Zhu Junyi, Gu Dizhou, Sun Yibo, Cui Yue

(Tonghua Normal University, Tonghua 134002, P. R. China); Song Hui(Jilin Agricultural University)

Schisandrachinensis(Turcz.) Bailey； Dregs； Polysaccharide； Purification； Lymphocyte transformation

郭志欣，女，1980年3月生，通化师范学院生命科学学院，讲师；吉林农业大学生命科学学院，博士研究生。E-mail:guozhixin800317@163.com.cn。

宋慧，吉林农业大学生命科学学院，教授。E-mail:conghuinongda@163.com。

2016年7月8日。

Q539

1)吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2011-307)。

责任编辑：潘 华。