小蓬竹植物内生真菌多样性1)

刘济明 柳嘉佳 颜强 熊雪 李丽霞 骆畅

(贵州大学，贵阳，550025)(贵州省社会科学院)(贵州大学)



小蓬竹植物内生真菌多样性1)

刘济明 柳嘉佳 颜强 熊雪 李丽霞 骆畅

(贵州大学，贵阳，550025)(贵州省社会科学院)(贵州大学)

以喀斯特地区特有濒危物种小蓬竹(DrepanostachyumluodianenseKeng f.)为研究对象，采用组织块分离法分离内生真菌，结合形态学特征与分子生物学鉴定的方法对分离到的菌株进行鉴定。研究其内生真菌的多样性，研究结果表明：从180个供试组织块中分离得到105株内生真菌，可划分为19个属，31种(含2个可能的新种)，相似度为95%～100%。在属的分类水平上，以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、炭角菌属(Xylaria)为优势菌属，分别占菌株总数量的12.38%和9.52%、6.67%、6.67%。小蓬竹内生真菌Shannon-Wiener多样性指数(H)为2.800，Simpson指数(D)为0.932，均匀度指数(E)为0.604，且在不同组织部位中小蓬竹内生真菌多样性也存在一定差异。Jaccard指数与Sorenson指数变化趋势一致，均为根茎的相似性最低，茎叶的相似性最高，而根和叶的居于两者之间。

小蓬竹；内生真菌；多样性

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(12)：71-75,90.

We studied on Endophytic Fungal diversity ofDrepanostachyumluodianense, which is unique endangered species of Karst area. Endophytic fungal were isolated by tissue isolation method and identified to species and gene level based on morphological characteristics and molecular analysis for cultivation, protection, exploit ofD.luodianenseand ecological restoration of vegetation in karst area. By statistics, 105 strains of Endophytic Fungal were isolated from the 180 tested tissues, and were divided into 19 genus, 31 strains (maybe including 2 species). Their homologies ranged in 95%-100%. In the genus classification level,Arthriniummortierellaaccounted for 12.38%,Fusariumfor 9.52%,Trichodermafor 6.67%, andGenusxylariafor 6.80%, and they were the dominant species. The Shannon-Wiener index (H) was 2.800, Simpson index (D) was 0.932, and evenness index (E) was 0.604, and there was difference for diversity of Endophytic Fungal fromD.luodianensein different plant part. The variation tendency of Jaccard index and Sorenson index were consistent, the highest homologies were in root and stem, the lowest in leaf and stem, and root and leaf were in between.

植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段，或全部阶段生活于健康植物各组织和器官内的真菌[1-3]。目前，国内外部分学者深入研究了部分植物内生真菌的组成和分布[4-7]。由于植物内生真菌具有丰富的多样性，所以要针对不同植物进行内生真菌多样性研究[8-9]。同时，要不断深入研究和分析同一植物不同季节和组织部位内生真菌的多样性[10-11]，进一步比较和探讨不同宿主植物组织间动态变化，对于丰富真菌的物种以及增强宿主植物的生长、抗逆性和修复作用都具有重要意义[12-13]。目前，关于小蓬竹内生真菌多样性的研究尚未见报道。本文通过对小蓬竹不同组织部位可培养内生真菌数量及菌群结构的研究，探明小蓬竹内生真菌多样性，以期对小蓬竹的引种栽培和保护与利用以及喀斯特地区植被和生态恢复提供理论依据与科学支撑。同时，也为认识内生真菌的生态学功能，内生真菌与宿主的关系以及竹类植物内生真菌资源的开发利用提供参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

供试植株取自于小蓬竹典型自然分布地——贵州罗甸县董架乡董架村打鸟槽处，属于典型的南亚热带季风气候，年平均气温18.6 ℃，年降水量在1 200 mm左右，土壤为典型的喀斯特石灰土，土壤肥力较高。

沿等高线分别设置5个样地(5 m×5 m)，调查样地内小蓬竹选取3点进行土壤因子调查，各样方随机选取10株，整丛挖出后，筛选出色泽鲜艳、健康的植株，将植株分为根茎叶，茎分为上中下3部分，分别取样分装并编号，用装有冰袋的取样箱带回。

1.2 培养基

25%双抗PDA培养基：马铃薯50 g，琼脂4 g，葡萄糖4 g，定容至1 000 mL,pH自然，150 mg/L庆大霉素和100 mg/L青霉素。

双抗竹秆煎汁琼脂培养基：竹秆200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g。蒸馏水1 000 mL，pH自然，150 mg/L庆大霉素和100 mg/L青霉素。

标准培养基:美国BD(Difco)公司生产的标准PDA(Potato dextrose agar)。

1.3 小蓬竹内生真菌分离

采用组织块分离法对内生真菌进行分离培养，用无菌刀片削去组织块两端,切成4 mm×4 mm×3 mm的组织块,然后分别接于25%双抗PDA培养基上，每个优化后的平板上6个琼脂块各接1个组织块，每种处理重复10个，根茎叶各60组织块，转到真菌培养箱，26 ℃恒温培养。用接种针挑取菌丝尖端部分转接至新的PDA培养基上，纯化2～3次后直至获得单一菌种。采用斜面保藏方法，在斜面上将待保藏菌株接入，编号后置于培养箱26 ℃培养4～7 d，待菌株生长旺盛后，置于冰箱中4 ℃保藏备用，定期检查[14]。采用组织印迹法、漂洗液洗涂布法、空白平板对照法三类检测方法配合，综合检测消毒效果，最大程度确保分离的菌是植物组织的内生真菌[15-17]。

1.4 小蓬竹内生真菌分子生物学鉴定

内生真菌DNA的提取、PCR扩增和序列测定：采用购买的生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取，对PCR扩增后的产物采用PCR产物纯化试剂盒Kit Ver.2.0(TaKaRa)进行纯化，然后采用1%琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)电泳检测DNA的质量。

PCR扩增产物采用真菌通用引物，其序列为：ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS4-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应体系(50 μL)：PCR Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL；ITS1-F 2 μL，ITS4-R 2 μL；双蒸水补足50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min后进行34个循环，每个循环包括94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环结束后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)电泳进行检测，并拍照。

内生真菌ITS序列的比对：所获序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司Invitrogen测序后，将测序结果提交NCBI的GenBank数据库，进行同源序列搜索(BLAST search)，选择与目的序列最相近的真实可靠的菌种序列作参考，使用Clustal X-2.0软件进行匹配排列，用MEGA 6构建邻接Neighbor-Joining分析方法进行系统发育分析。

1.5 数据统计与处理

采用分离率(IR)、分离频率(IF)衡量植物组织中内生真菌的丰富程度，比较判断优势菌群，同时采用Shannon-Wiener指数(H)、Simpson指数(D)、均匀度指数(J)分析小蓬竹内生真菌的多样性特征，用相似性系数(CS)和Jaccard(Cj)分析不同组织或样本中内生真菌种类组成的相似程度。

(1)

(2)

(3)

CS=2j/(a+b)，

(4)

CJ=j/(a+b-j)。

(5)

式(1)、(2)、(3)中：Pi是第i种的比例多度，S为物种总数目。

式(4)、(5)中:j为两个组织或样本共同具有的内生真菌种类数，a、b分别为每个组织或样本中的内生真菌种类数。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的组成

试验采用组织块分离法从180个供试小蓬竹组织块(根、茎和叶各60块)中分离内生真菌，共有85块被内生真菌侵染(见表1)，其中根44块，茎21块，叶20块。共计从中分离得到105株内生真菌，其中从根中分离出63株，茎中14株，叶中28株。其中根中内生真菌的分离频率最高，达到60%；茎和叶中分离到的内生真菌分别占总菌株数的13.33%和26.67%。在根组织中，共有63株菌，分布于17个菌属，其中镰刀菌属与漆斑菌属的分离频率最高，均占总菌株数的7.62%；茎中有14株菌6个属，分布比较均，拟茎点霉属、弯孢聚壳属等为优势菌属，占总菌株数的1.90%；叶片中，28株菌分布于9个属，节菱孢霉属分离频率为7.62%，为优势菌属。

2.2 内生真菌的ITS-rDNA序列分析及系统发育树的建立

基于ITS序列BLAST分析将所分离到的105株菌株归属为19个属，31种(含2个可能的新种)，通过进行BLAST search并与数据库中序列相近的菌种进行比对(见表2)，发现该105株菌株的序列同源性都较大，都达到了95%～100%。再将获取的不同基因型的菌株采用MEGA6.0构建(Neighbor-Joining)系统进化树(见图1)。

分离到的105株真菌均属于子囊菌门(Ascomycota)的盘菌亚门(Pezizomycotina)，在纲的分类水平上，以粪壳菌纲(Sordariomycetes)优势菌群占菌株总数的85.71%，散囊菌纲(Eurotiomycetes)占菌株总数的5.71%，座囊菌纲(Dothideomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)与丝孢子菌纲(Hyphomycetes)分别仅占菌株总数的4.76%、1.90%；从目的分类水平上共有10个分类单元，以炭角菌目(Xylariales)、肉座菌目(Hypo Creales)为优势菌群，分别占菌株总数的24.76%和25.71%；在科的分类水平上，共有17个分类单元，以丛赤壳科(Nectriaceae)、梨孢假壳科(Apiosporaceae)为优势菌群，分别占总菌株数的9.52%、12.38%；在属的分类水平上，共有19个分类单元，以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、炭角菌属(Xylaria)为优势菌属，分别占菌株总数的12.38%和9.52%、6.67%。结果表明：小蓬竹植株中具有丰富的真菌物种多样性。

表1 不同组织内内生真菌菌群的组成及分离频率

表2 基于ITS序列BLAST分析和形态学特征推断内生真菌的分类单元

续(表2)

图1 邻接法构建ITS序列的系统进化树

2.3 不同组织内生真菌分布多样性及相似性

从多样性指数来看，小蓬竹内生真菌多样性指数(H)、Simpson指数(D)依次为2.800、0.932，均匀度指数(E)为0.604。但在不同组织中小蓬竹内生真菌多样性也存在一定差异。总的来看，在多样性指数方面，Shannon-Wiener和Simpson指数在不同组织中的变化趋势一致，均为根最高，茎其次，叶片最低。茎的均匀度指数(E)最高，为0.775，叶的最低为0.597(见表3)。结果表明，小蓬竹植株中存在大量的内生真菌，并且根中内生真菌数量和种群多样性远高于叶和茎内。

表3 小蓬竹根、茎、叶内生真菌多样性指数

表4对不同组织中内生真菌菌群的相似性比较发现：Jaccard指数与Sorenson指数变化趋势一致，均为根茎的相似性最低，茎叶的相似性最高，而根和叶的居于两者之间。此外，Jaccard指数都不大于0.5，Sorenson指数稍大于0.5(见表4)，这表明小蓬竹的内生真菌菌群各组织间差异是适中的，虽具有一定的相似性，但相似性不高，各组织中分布的内生真菌各有其特点。

表4 小蓬竹内生真菌菌群相似性系数比较

注：表中对角线以上为Jaccard指数，以下为Sorenson指数。

3 结论与讨论

本研究明确了喀斯特地区的小蓬竹内生真菌的组成结构，粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势菌群，可分为19属，其中以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、炭角菌属(Xylaria)为优势菌属。这与有关竹类真菌分类鉴定方面的研究基本相符[18-19]。考虑竹类的生物特性，普遍被认为其内生真菌的腐生性较强、或为潜伏性病原菌菌属，为排除相关干扰，所采集的样本全部来自完全没有受到伤害或感染病害健康植株，并且实验采用组织印迹法、漂洗液洗涂布法、空白平板对照法三类检测方法配合，综合检测消毒效果，确保分离的菌是植物组织的内生真菌。因此，一些常见植物病原菌和腐生菌菌群，却是在健康小蓬竹植物中普遍大量存在。主要是因为真菌与宿主两者间互作用的结果随着环境因子(气候、土壤性质等)、宿主种类和生理状态、真菌基因型的变化都可能改变[20]。一方面，对于同一菌株对不同植株而言，随着环境条件和宿主生理状况的改变，菌类的基因型极易发生突变，可能由致病菌的偏利共生，甚至寄生变为互惠共生，从而表现出不同的生活方式。致病性炭疽菌(Colletotrichum)的突变株可以定殖在葫芦科植物如西瓜和南瓜上，表现出如抗病、促进生长和抗旱等偏利共生或互惠共生的生活方式[21]。另一方面，有些内生真菌属于潜在性病原菌，在宿主抵抗力下降或者某一生长阶段才表现出致病性。此外，特定的环境条件，内生真菌包括炭疽菌、镰刀菌和拟茎点霉等[22-23]可能发挥腐生菌的功能，产生腐生菌相似的细胞降解酶[24]。综上研究表明，小蓬竹内生真菌的组成与种类与其喀斯特石漠化特殊生境有密不可分的关系。

小蓬竹不同组织中内生真菌的数量、种类及分布存在显著性差异，这体现了内生真菌的组织偏好性和特异性，可能是由于不同部位的结构成分不同、生长年限不同、富含的营养物质不完全相同，以及真菌在土壤与空气中传播机制的不同造成的[25]。综合来看，根部分离到的内生真菌数量种类最多、多样性指数最高，叶片其次，茎中最少的但分布均匀。这与孙丽等[26]的新疆阿魏、陈立军等[27]油菜的内生真菌的分离鉴定结果相符。同时与小蓬竹其地下茎合轴型，一年生与多年生根部混生，竹秆在地面密集丛生的生物特性关系密切：一方面由于很多源自土壤的内生真菌从根部侵入向上扩展，再入侵到茎部；另外雨水飞溅、空气流动也使叶片接触到微生物的机会也比茎部相对更多。此外，在喀斯特相对贫瘠的土壤上，根中所含的营养物质比茎、叶丰富也是不可忽视的因素。

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Diversity of Endophytic Fungal fromDrepanostachyumluodianense

Liu Jiming, Liu Jiajia

(Guizhou Uniersity, Guiyang 550025, P. R. China); Yan Qiang(Guizhou Provincial Academy of Social Science); Xiong Xue, Li Lixia, Luo Chang(Guizhou Uniersity)

Drepanostachyumluodianense; Endophytic fungal; Diversity

刘济明，男，1963年6月生，贵州大学林学院，教授。E-mail:karst0623@163.com。

2016年6月26日。

Q938.1

1)贵州省国际科技合作计划[黔科合外G字(2013)7010号]。

责任编辑：潘 华。