柱前衍生高效液相色谱法测定酵母培养物中甘露聚糖的含量

■张相飞 刘 明 李文辉

（1.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛266109；2.北京中农弘科生物技术有限公司，北京102206；3.廊坊市农业局，河北廊坊065000）

酵母培养物是利用酵母菌在特定工艺条件控制下采用特殊的培养基发酵生产出来的一种成分复杂的微生态制品,它含有酵母细胞外代谢产物、变性的培养基和少量的酵母细胞。目前的研究表明，酵母培养物作为一种饲料添加剂能够有效降低有害菌的增殖，改善仔猪肠道微生物菌群，减少肉仔鸡大肠杆菌数量和增加乳酸杆菌数量。酵母培养物可显著提高瘤胃中羧甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶的酶活性，加快饲料纤维易降解成分的消化速度，提高纤维的消化率，改善初产奶牛围产期的体况，提高奶牛日均产奶量，改善奶牛生产性能。酵母培养物中的酵母甘露聚糖具有增强机体免疫能力、抗辐射、抗细菌病毒等功效，是酵母培养物中的重要的功效成分之一。因此，酵母甘露聚糖的含量被认为是评价酵母培养物品质的一项重要指标。

对单糖含量的测定一般采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但采用上述方法用于测定酵母培养物中的甘露聚糖含量时，得到的结果是总的还原糖，不能排除其他糖类的干扰，专一性差，测定结果不能准确反映样品中甘露聚糖的实际含量。

还原性糖在碱性条件下能与糖类常用的衍生试剂PMP发生定量反应，所生成的衍生物稳定、紫外吸收强。酵母培养物经均质处理使其中的酵母细胞充分破壁后，其中的酵母多糖在硫酸作用下，水解得到单糖。单糖用PMP衍生化后，再以0.1 mol/l pH值5.5的乙酸铵缓冲液-乙腈（V/V，70∶30）为流动相洗脱，反相C18柱分离，用紫外检测器（波长250 nm）检测，测得单糖的含量通过换算后得到酵母培养物中甘露聚糖的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪、高速均质机（昂尼AD200L-P）、PB-10型pH计（赛多利斯）、台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验试剂

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、氯仿（分析纯）、盐酸（分析纯）、乙酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（分析纯）、超纯水、甘露糖标准品（含量98%，上海源叶生物）、甘露聚糖标准品（含量98%，上海源叶生物）。

1.3 标准溶液配制

准确称取甘露糖标准品0.05 g（精确到0.000 1 g）于100 ml容量瓶中，加水溶解后定容到100 ml容量瓶中，作为标准储备溶液。用前取10 ml储备溶液定容到100 ml容量瓶中作为标准溶液。

1.4 样品处理

准确称取样品4.5 g于烧杯中，加水至30 g（准确至0.000 1 g），用高速均质机10 000 r/min条件下处理10 min。准确称取其中0.5 g作为试样，放入25 ml耐压反应管中，加入72%硫酸2.5 ml，摇匀静置1～3 h，加超纯水12.5 ml后，密封耐压反应管在100℃下搅拌水解4 h，水解完成后将高压反应管用冰水冷却，水解液移入容量瓶中，定容到100 ml，此为试样溶液。取其中10 ml用6 M的NaOH溶液调为中性，再定容到100 ml，为待测样品溶液。

衍生化反应参考林钦恒等方法并进行适当优化。取甘露糖标准溶液或试样溶液、0.5 mol/l PMP甲醇溶液（须现配现用）、0.3 mol/l NaOH溶液各400 μl，置于10 ml具塞离心管中，充分混匀后于70℃水浴衍生化反应30 min，放冷后加入0.3 mol/l盐酸溶液500 μl，混匀，用三氯甲烷萃取出过量的PMP，洗涤4次每次用2.5 ml三氯甲烷，最后将水层液离心后，取上清液待测。

1.5 色谱条件

色谱柱Waters®C18Bondapak 300 mm×4.9 mm；流动相：0.1 mol/lpH值5.5的乙酸铵缓冲液-乙腈（V/V，70∶30）；流速1.0 ml/min；柱温35 ℃；检测波长250 nm；进样量20 μl。

1.6 样品的测定

在同样的色谱条件下，将衍生化反应后的样品和标准品分别注入色谱仪中，记录各色谱峰的峰面积。每份样品重复两次结果取平均值。

试样中甘露聚糖的含量计算公式为：

式中：X——甘露聚糖含量（%）；

A1——标样溶液中甘露糖峰面积的平均值；

A2——试样溶液中甘露糖峰面积的平均值；

M1——甘露糖标样的质量（g）；

M2——试样溶液中酵母培养物的质量（g）；

P1——甘露糖标样中甘露糖的质量百分含量（%）；

0.9——甘露糖和甘露聚糖的换算系数；

F——样品酸水解过程中甘露糖被破坏造成结

果偏低的补偿系数，其计算公式为：

式中：P——甘露聚糖标样中甘露聚糖的质量百分含量；

X1——准确称取0.03 g甘露聚糖标样按照前述方法水解衍生测定后，通过甘露糖标准曲线计算出的甘露聚糖浓度（mg/l）；

M——甘露聚糖标样的质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 色谱分离

以上述方法及色谱条件下所得甘露糖和酵母培养物HPLC色谱图，如图1所示。甘露糖PMP衍生物的分离度大于1.5，分离效果良好，基线呈水平状，峰形对称。

2.2 线性相关度和标准曲线

在上述方法及色谱条件下，测定一系列浓度梯度的甘露糖标准品色谱图（见图1）。以甘露糖标准溶液浓度（mg/l）为横坐标x，以对应的色谱峰面积（v·s）为纵坐标y，绘制标准曲线，见图2。

图1 甘露糖标准溶液及样品PMP衍生化的HPLC色谱图

图2 甘露糖标准曲线

结果表明甘露糖浓度在1.0～100.0 mg/l范围内与对应峰面积呈线性关系，线性回归方程y=0.014 9x+0.006 1及相关系数（R2=0.998 1）。

2.3 方法精密度、添加回收率和最低检测限

取酵母培养物样品，按上述处理方法和色谱条件进行5次平行测定，测得结果统计求出相对标准偏差。结果表明该方法的相对标准偏差2.5%。取已知准确含量的酵母培养物样品，加入一定量的甘露聚糖标准品，然后按照上述处理方法和色谱条件进行测定，测得结果以测定值减去本底值比添加值求出回收率，重复处理5次，计算得到其添加回收率为96.3%～102.6%。按照3倍信噪比通过换算得到甘露聚糖最低检测限（S/N=3）为0.11 mg/l。

2.4 讨论

酵母培养物中的甘露聚糖存在于酵母细胞壁的外层，采用一些方法例如均质处理可以使酵母细胞破壁，从而使得甘露聚糖在酸性条件下充分水解。单糖类物质也可使用糖分析柱结合利用示差检测器检测，但糖柱不耐用，对应的示差检测器灵敏度较低，不适合检测酵母培养物中的甘露聚糖。单糖衍生化后可以利用反相色谱柱进行分离，采用紫外检测器便能更加灵敏的检测出单糖衍生物。如马晓丽等利用PMP衍生结合高效液相色谱分析了大蒜多糖中的单糖组成及摩尔比。

林雪认为衍生反应时间在30 min以上时，单糖和PMP衍生反应程度基本趋于稳定，冯学珍等认为单糖的PMP衍生化与反应温度和时间有一定的关系，在70℃水浴下能生成稳定的化合物。因此从时间效率上考虑将反应时间选择为30 min，反应温度选择为70℃。

3 结论

酵母培养物经均质处理后，多糖用硫酸水解，以PMP为单糖的衍生化试剂，以0.1 mol/l pH值5.5乙酸铵缓冲液∶乙腈（V/V，70∶30）为流动相，流速1.0 ml/min。用紫外检测器在波长250 nm下检测且以外标法计算，能够准确地测定酵母培养物中甘露聚糖的含量。该方法简便准确，适用于酵母培养物及类似样品中甘露聚糖的含量测定。