外源酶制剂对黄颡鱼免疫抗氧化指标和肠道形态结构的影响

■ 王国霞 曹俊明 牛凤池 黄文庆 胡俊茹 陈 冰 范怡杰 黄燕华 *

（1.广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州510640；2.广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州510640；3.广东省动物育种与营养公共实验室，广东广州510640；4.广州飞禧特水产科技有限公司，广东广州510640）

肠道是动物吸收营养物质的重要场所，同时又是机体最大的微生态系统，肠道受损会导致机体病态，影响营养物质消化利用，影响动物生长。宋霖等[1]研究发现黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肠道对饲料植物蛋白豆粕、菜粕和花生粕添加量很敏感，过多对肠道形态结构有负面影响。陈燕[2]研究发现，配方中增加植物性蛋白源使用会导致黄颡鱼肠道组织结构形态损伤，甚至发生病理变化而影响生长。而鱼粉的紧缺及价格上涨使得黄颡鱼配方中不得不多用植物蛋白原料。植物蛋白源存在一些抗营养因子如植酸盐和大豆抗原蛋白，植酸盐不能很好的被鱼类消化利用[3-4]，同时对蛋白的消化[5]和矿物的利用率有负面影响[6-8]。目前，在配合饲料中添加酶制剂，成为解决植物性原料抗营养因子进而改善肠道健康的有效途径之一。大豆抗原蛋白对养殖动物具有免疫原性，过多摄入会影响肠道的发育，降低肠道消化及免疫能力。据报道，在蛋鸡饲料[9-10]中添加植酸酶能提高肠绒毛高度，改善肠道健康状况，也有植酸酶[11]和复合酶[12]在肉鸡中有改善肠道组织形态结构的类似报道。酶制剂对鱼类肠道组织影响的研究报道相对较少，如在虹鳟中添加外源蛋白酶可以提高肠道皱襞高度、面积，进而改善肠道健康[13]。已有在黄颡鱼饲料中添加植酸酶[14-15]提高生长、消化率等，及复合酶[16-17]促生长的报道，且饲料转化率偏低，也没有对肠道组织影响的指标。为此，本试验对饲料配方进行了进一步优化，国产鱼粉用量为26%，蛋白源主要为植物性原料进行配制，研究植酸酶和该复合酶对黄颡鱼血清免疫抗氧化指标和肠道形态结构的影响，同时对比两种酶的效果，为植酸酶和复合酶在黄颡鱼饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以含26%鱼粉、32%豆粕、10%棉粕和10%双低菜粕等的黄颡鱼实用饲料为基础饲料，原料组成和营养水平见表1。在基础饲料中分别添加1 000 IU/kg植酸酶、400 mg/kg复合酶制剂配制2种试验饲料。原料粉碎后过40目筛，按配方准确称量原料逐级混匀，通过SLX-80型双螺杆挤压机制成1.5 mm的颗粒饲料，55℃下烘干，自然冷却后置于-20℃冰箱中保存备用。植酸酶（2 000 U/g）由广东溢多利生物科技股份有限公司提供；复合酶制剂（蛋白酶2 200 U/g、淀粉酶4 000 U/g、纤维素酶20 U/g、脂肪酶14 U/g、果胶酶180 U/g）由某知名企业提供。

表1 基础饲料组成及营养水平（风干基础）

1.2 样品采集及测定

饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室室内循环水养殖系统中进行，水体体积约为300 L。选取（1.02±0.01）g健康的黄颡鱼360尾，随机分成3组，每组4个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂基础饲料和2种添加饲料，记作对照组、植酸酶组和复合酶组。正常养殖56 d。养殖试验结束后停食24 h，每缸随机取8尾鱼，用1 ml无菌注射器于尾静脉取血，常温下静置4 h后用离心机于4℃3 500 r/min离心10 min，取上清液分装后置于-80℃冰箱保存备用。免疫、抗氧化指标采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，方法参照说明书进行。采血后每缸随机取2尾鱼解剖取胃部后端膨大处1 cm的前肠，放入福尔马林固定液中保存，制备石蜡组织切片，HE染色光镜观察，运用Image-Pro Plus进行肠道组织学测量。

1.3 统计分析

试验结果采用“平均数±标准差”表示。采用SPSS 17.0统计软件对结果进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若差异显著则对所有数据进行Duncan's法多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 黄颡鱼血清免疫抗氧化指标（见表2）

表2 外源酶制剂对黄颡鱼免疫和抗氧化指标的影响

表2 （续） 外源酶制剂对黄颡鱼免疫和抗氧化指标的影响

由表2可知，各组酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶及抗超氧阴离子自由基含量无显著差异（P＞0.05）；与对照组比较，试验组超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）均有升高，其中SOD分别提高了17.81%、12.99%，植酸酶组T-AOC提高14.92%，但差异不显著（P＞0.05）；试验组丙二醛含量较对照组有所下降，其中复合酶组下降幅度达到17.88%，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 黄颡鱼前肠形态和结构

各组黄颡鱼的前肠形态结果如图1～图3所示。对照组黄颡鱼前肠肌肉层较薄，褶皱数量及高度均较小，褶皱断裂现象明显；植酸酶组和复合酶组肌肉层较厚，褶皱数量增多，高度增加，排列整齐，断裂较少。

外源酶制剂对黄颡鱼前肠组织结构的影响见表3。由表3可知，试验组黄颡鱼前肠肠壁厚度和肠绒毛高度均高于对照组，植酸酶组分别提高了2.27%、3.76%，复合酶组分别提高了16.28%、15.22%，但差异不显著（P＞0.05）。

图1 对照组前肠组织结构（HE）

图2 植酸酶组前肠组织结构（HE）

图3 复合酶组前肠组织结构（HE）

表3 外源酶制剂对黄颡鱼前肠组织结构的影响（μm）

3 讨论

3.1 对黄颡鱼血清免疫、抗氧化指标的影响

SOD能够催化超氧化物歧化为氧气和过氧化氢，属于金属酶，是一种活性氧清除剂，在防止生物大分子氧化损伤方面具有重要作用。它可以将超氧阴离子（O2-·）歧化为过氧化氢（H2O2）和氧气（O2），从而避免自由基对机体造成的氧化损伤[18]。GSH-Px是机体内重要的过氧化物分解酶，催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，防止细胞膜氧化。T-AOC的大小既可以反映机体清除氧自由基的能力，也反映了机体对外来刺激的代偿能力。MDA作为脂质氧化终产物，具有细胞毒性，含量的多少可反映脂质氧化及细胞受损情况。通常将SOD和MDA测定相互配合，共同评价机体抗氧化能力强弱。Zhu等[14]研究发现，植酸酶添加于黄颡鱼幼鱼饲料（低鱼粉10%和低蛋白30%）中可通过提高其血液中ROS、SOD和CAT含量进而提高抗氧化力，但对血清AKP没有影响。马恒甲等[19]报道，在草鱼全植物蛋白饲料中添加植酸酶为1 000～1 250 U/kg时有助于草鱼的非特异性免疫机能的提高，在建鲤饲料中添加2 500 IU/kg植酸酶后，血清中溶菌酶、酸性磷酸酶显著提高[20]。而在1～4周龄五龙鹅饲粮中添加植酸酶可以提高血清中T-AOC和AKP活力，增强机体抗氧化能力和免疫力[21]。本试验中添加植酸酶对AKP、SOD、GSHPx、T-AOC有一定程度提高，且丙二醛含量下降，与上述报道不太一致，即添加植酸酶改善或提高机体抗氧化能力和免疫力的效果在不同动物或同一动物不同配方中不同，目前相关报道较少，有待更多研究。

戚传利等[22]报道，饲料中添加复合酶显著提高了刺参体腔液的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）和碱性磷酸酶（AKP）活性。在草鱼幼鱼饲料中添加以木聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶为主的600、900 mg/kg复合酶制剂可以显著提高血液中白细胞的吞噬活性、血清杀菌能力[23]。王国霞等[17]在黄颡鱼低鱼粉（5%）饲料中添加100～200 mg/kg复合酶制剂时血清LZM活性显著升高。这与钟国防等[24]和谢骏等[25]对奥尼罗非鱼的研究和黄峰等[26]对异育银鲫的研究结果一致。以上报道说明复合酶能提高鱼体的体液免疫因子，进而提高其抗氧化力或免疫力。而本试验中添加复合酶对黄颡鱼血清SOD、GSH-Px、T-AOC有一定程度提高，对免疫指标ACP和AKP没有影响，与已有报道不太一致，分析跟饲料配方、复合酶种类配比及使用剂量有关。

3.2 对黄颡鱼前肠组织形态、结构的影响

肠道是机体重要的消化器官，也是机体最大的微生态系统，同时兼有免疫、排毒等功能，维持鱼体肠道良好的消化吸收功能，对于鱼体的快速生长及抵御病害均有重要的作用。研究表明，在蛋鸡[9-10]和肉鸡[11]饲粮中添加植酸酶能够促进肠道发育和改善肠道形态结构。本实验室前期研究表明，饲料中添加植酸酶可以增加花鲈前肠肌肉层厚度、绒毛高度和密度，增加固有层和上皮细胞间的紧密度[27]。本试验中，添加1 000 IU/kg的植酸酶后，黄颡鱼肠壁厚度及肠绒毛高度均有所提高，但差异不显著，与上述研究相似。分析是植物蛋白源中含有植酸，与营养物质络合影响鱼体消化吸收，导致肠道营养供应不足，影响肠道健康，植酸酶通过分解植酸释放营养物质，改善肠道营养状况进而改善肠道形态。

饲料中植物蛋白源含量过高时会对鱼体肠道造成损伤，鱼体肠道受损情况通常与植物蛋白源的种类及含量相关，鱼体消化器官受损可能与植物蛋白源中蛋白酶抑制因子和皂荚等有关[28]。张伟[29]研究发现，大豆皂甙可造成异育银鲫肠道结构发生病理性变化，如黏膜皱襞变短、肌层变薄、上皮细胞排列紊乱等。Buttle等[30]也报道，在大西洋鲑和虹鳟饲料中添加高水平豆粕时，因为大豆凝集素在体内与肠上皮细胞结合，导致其肠道受损。张娟娟等[13]报道，在虹鳟中添加外源蛋白酶可以提高肠道皱襞高度、面积进而改善肠道健康。本试验中，复合酶制剂组黄颡鱼肠道肠绒毛高度和肠壁厚度均高于对照组，虽未达到显著水平，但也说明复合酶制剂的添加对黄颡鱼肠道形态有所改善，结果与之类似。本试验所用配方中植物蛋白原料高达52%，植物蛋白源中含有抗营养因子，影响黄颡鱼消化吸收，且对肠道造成一定影响，该复合酶制剂含有蛋白酶、淀粉酶等，可消除部分抗营养因子对肠道造成的不良影响，增加消化酶分泌进而提高其活性，使肠道营养物质更加均衡，调节肠道微生物进而改善肠道形态。

4 结论

在黄颡鱼实用饲料中分别添加植酸酶和复合酶能一定程度提高血清SOD、GSH-Px、T-AOC和降低MDA含量而改善鱼体抗氧化力；同时能够增加黄颡鱼肠道肠壁厚度，提高肠绒毛高度，改善鱼体肠道健康。