地黄多糖粉质量标准研究

孙月川，郑 桦，刘 静，王 琳，刘聚祥*

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071000；2.井陉县动物卫生监督所，河北石家庄 050300)

地黄多糖粉质量标准研究

孙月川1，郑 桦2，刘 静1，王 琳1，刘聚祥1*

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071000；2.井陉县动物卫生监督所，河北石家庄 050300)

为建立地黄多糖粉的质量标准，采用Molish法联合薄层色谱法进行鉴别，通过苯酚硫酸法对多糖和高效液相色谱法对梓醇进行含量测定。结果表明，Molish法显色明显，薄层色谱法斑点清晰；多糖在11.1 μg/mL～111 μg/mL的范围内，吸光度值与葡萄糖浓度呈良好的线性关系(R2=0.994 8)，平均加样回收率为98.74%，RSD为2.61；梓醇在10.5 μg/mL～105 μg/mL的范围内，峰面积与进样浓度呈良好的线性关系(R2=0.999 2)，平均加样回收率为99.09%，RSD为1.63。说明建立的方法简便、准确、可靠，可用于该制剂的质量控制。

地黄多糖；梓醇；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

地黄是玄参科植物地黄(RehnanniaglutinosaLibosch) 的新鲜或干燥块根，为我国四大怀药之一，始载于《神农本草经》，列为上品，具有悠久的药用历史。根据炮制方法不同分为鲜地黄、生地黄和熟地黄。生地黄性味甘、寒，入心、肝、肾经，为清热凉血之品，有清热生津，滋阴养血之功；熟地黄补血滋阴、益肾填髓；鲜地黄有清热生津、凉血止血的功效。生地黄中的主要活性成分为糖类、环烯醚萜苷和氨基酸等，其中以地黄多糖和梓醇药理作用广泛[1]。现代药理学表明，地黄多糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、促进机体造血等作用[2-4]。梓醇具有神经保护，抗肿瘤，降血糖等多种功效[5-7]。

地黄多糖粉是保定市冀农动物药业有限公司开发的新型中药制剂，是以地黄多糖和梓醇的得率为指标将生地黄经回流提取，而后对浓缩液进行喷雾干燥得到的中药粉剂。兽医临床上主要用于提高动物免疫力。为保证临床疗效，有效控制产品质量，并为制定国家质量标准提供参考，本研究参照2010版《中国药典》中地黄药材的定性定量方法，对地黄多糖粉主要成分地黄多糖和梓醇进行鉴别和含量测定，建立地黄多糖粉的质量标准。

1 材料与方法

1.1 材料

Waters高效液相色谱仪，Waters 2998光电二极阵列检测器、Breeze色谱工作站，紫外分光光度计，岛津UV-1750；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HH-W420数显三用恒温水浴箱，金坛市医疗仪器厂；SP-1500实验型喷雾干燥机，上海顺仪科技公司；TS-NS系列提取浓缩机组，上海顺仪科技公司；硅胶G板青岛鼎康有限公司；生地黄产地为河南怀庆，地黄对照药材，中国药品生物制品检定所，批号：121180-201005；梓醇标准品，中国食品药品检定所，批号：110808-201210；葡萄糖标准品，中国食品药品检定所 ，批号：110833-201311；乙腈、甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 定性鉴别 糖类的鉴别方法有：①Molish法。取地黄多糖粉0.1 g，加水10 mL，浸泡，取上清液1 mL，加入50 g/L的α-萘酚乙醇液(250 mL/L乙醇)2滴～3滴，摇匀后，沿试管壁缓缓加入浓硫酸1 mL。②薄层色谱法。取地黄多糖粉1 g，加水5 mL，作为供试品溶液。另取地黄对照药材1 g，加水20 mL，超声处理15 min，滤过，将滤液浓缩至2 mL，作为对照溶液。取辅料1 g，加水5 mL，作为阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以乙醇-浓氨试液-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出晾干，喷以30 g/L茚三酮乙醇液，热风吹至斑点显色清晰。

梓醇的鉴别方法：取地黄多糖粉2 g，加入甲醇20 mL，加热回流提取1 h，滤过，浓缩至5 mL，作为供试品溶液。取地黄对照药材，按上述相同的方法制备供试品溶液。另取梓醇对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法，吸取上述溶液各5 μL点样于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸甲醇液(1∶9)，105℃烤干至斑点显色清晰。

1.2.2 含量测定

1.2.2.1 地黄总糖的含量测定 ①对照品溶液的制备。取葡萄糖标准品，干燥至恒重，取22.2 mg溶解在100 mL水中，配制成222 μg/mL的溶液。 ②供试品溶液的制备。取20 mg地黄多糖粉，溶解在100 mL的蒸馏水中，配制成200 μg/mL的溶液。精密吸取上述溶液1 mL于试管中加蒸馏水1 mL，加入50 g/L苯酚试剂1 mL，摇匀，迅速精密滴加浓硫酸5 mL，快速混匀，放5 min，沸水浴中加热15 min，冷却至室温，在490 nm处测得吸光度。 ③标准曲线的制备与线性关系的考察。精密吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置试管中，分别加蒸馏水至2.0 mL，精密加入50 g/L苯酚试液1 mL，摇匀，迅速精密滴加浓硫酸5 mL，快速混匀，放5 min，沸水浴中加热15 min，冷却至室温。在490 nm处测得吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 ④稳定性试验。取同一供试品，在490 nm处测定吸光度，分别于0、30、60、90、120 min测定吸光度，计算RSD。 ⑤重复性试验。取同一批样品， 6份，按1.2.2.1.2的方法制备，分别测定吸光度，计算RSD。 ⑥精密度试验。取样，按②的方法制备供试品，重复测定6次，测定吸光度，计算RSD。 ⑦加样回收试验。加样对照品的配制：取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.6 mg，溶解在100 mL的容量瓶中，配成106 μg/mL的加样对照品溶液。

回收率试验：精密称取同一批已知含量的样品6份，配制成200 μg/mL的溶液，吸取0.5 mL，加入0.5 mL的蒸馏水，每份再精密加入对照品溶液(106 μg/mL)1 mL，加入50 g/L的苯酚试剂1 mL，摇匀，迅速精密滴加浓硫酸5 mL，快速混匀，放5 min，沸水浴中加热15 min，冷却至室温。在490 nm处测得吸光度，计算回收率及RSD。

1.2.2.2 梓醇含量的测定 ①色谱条件。色谱柱：XBridgeTMC18( 5μm 4.6×250mm)；柱温30℃；检测波长210 nm；流动相：乙腈-水(1∶99)；进样体积20 μL；流速1 mL/min。②对照品溶液的制备。精密称取梓醇对照品10.5 mg，置于100 mL容量瓶中，以流动相(10 mL/L乙腈)溶解稀释至刻度，摇匀既得。③供试品溶液的制备。取样品约100 mg，精密称量，置于圆底烧瓶中，加入50 mL 600 mL/L的甲醇，称定质量，加热回流提取1.5 h，冷却后再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，继续提取1.5 h。摇匀，过膜，量取滤液25 mL，减压浓缩至干燥，残渣用流动相(10 mL/L乙腈)溶解，转移定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得。④标准曲线的制备与线性关系的考察。取②下的溶液，用流动相(10 mL/L乙腈)配成10.5，21，42，63，84，105 μg/mL的溶液，按①的色谱条件，分别进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标Y，以进样浓度为横坐标X，进行线性回归，绘制标准曲线。⑤稳定性试验。取同一供试品，按①项下色谱条件进行测定，分别于0 、2 、4 、6 、8 、12 h进样，记录色谱图，计算峰面积及RSD。⑥重复性试验。取同一批次样品，按③项下的方法制备6份，按①项下的色谱条件，分别测定，记录色谱图， 计算峰面积及RSD。⑦精密度试验。取同一标准品溶液20 μL，按①项下的色谱条件，重复进样6次，记录色谱图， 计算峰面积及RSD。⑧加样回收试验。加样对照品的配制：精密称取梓醇对照品10.5 mg，置于100 mL的容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，既得。

回收率试验：精密称取同一批已知含量的样品6份，每份精密加入梓醇(105 μg/mL)10 mL，10 mL蒸馏水，30 mL的甲醇，按③项下的方法制备供试品，分别进行测定，计算回收率及RSD。

1.2.2.3 样品的含量测定 取3批样品，按照上述方法对样品中地黄总糖和梓醇进行含量测定。

2 结果

2.1 定性鉴别结果

2.1.1 糖类的鉴别 ①Molish法：两液交界面现紫红色环，表明样品中含有糖类。 ②薄层色谱法：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点(图1)。

2.1.2 梓醇的鉴别 供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显示出相同的颜色斑点，结果如图2。

2.1.3 鉴别结果 考虑到梓醇为地黄特征成分和操作的简单快速，本鉴别项将Molish法和梓醇的薄层鉴别列入质量标准项。

2.2 含量测定结果

2.2.1 地黄总糖的含量测定 葡萄糖标准曲线结果表明，葡萄糖质量浓度在11.1 μg/mL～ 111 μg/mL的范围内呈良好的线性关系(图3)。稳定性试验结果表明，测定得到0、30、60、90、120 min的吸光度，RSD为1.18%，说明供试品溶液在2 h内基本稳定。

1.地黄多糖粉; 2.地黄对照药材;3.阴性对照

1.Rehmanniapolysaccharide powder;2.Radix rehmanniae reference substance;3.Negative control

图1 地黄多糖薄层色谱鉴别图

Fig.1 Thin layer chromatogram ofRehmanniaglutinosapolysaccharide

1.梓醇标准品；2.地黄多糖粉；3.地黄对照药材

1.Catalpol reference substance; 2.Rehmanniaglutinosapolysaccharide powder; 3.Radix rehmanniae reference substance

图2 梓醇的薄层色谱鉴别图

Fig.2 Thin layer chromatogram of catalpol

重复性试验结果表明，测定得到6次重复性试验的吸光度值，RSD为2.04%，说明该方法重复性良好。 精密度试验结果表明，分别得到重复测定6次的吸光度值，RSD为0.09%，说明仪器精密度良好。

加样回收试验结果表明，平均加样回收率为98.74%，RSD为2.61%(表1)。

2.2.2 梓醇含量测定结果 色谱条件的考察：在色谱条件下，样品中的梓醇与其他峰均达到基线分离，梓醇峰保留时间为8.5 min(图4)。

图3 葡萄糖的标准曲线

表1 葡萄糖加样回收试验结果

Table 1 Recovery rates of standard addition of Glucose

样品中质量/μgSamplequantity加入质量/μgAddedquantity测得的质量/μgDetectedquantity回收率/%Recoveryrate平均回收率/%MeanrecoveryrateRSD/%10410620797.17101106210103.7710110620497.179310619697.179910620499.069410619898.1198.742.61

梓醇的标准曲线结果表明，梓醇质量浓度在10.5 μg/mL～105 μg/ml的范围内，线性关系良好(图5)。

稳定性试验结果表明，测定得到0、2、4、6、8、12 h梓醇峰面积值，结果RSD为1.39%，说明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验结果表明，分别得到6次重复试验的梓醇峰面积值，RSD为1.36%，说明该方法重复性良好。

精密度试验结果表明，重复进样6次分别得到梓醇峰面积值，RSD为0.8%，说明仪器精密度良好。

加样回收试验结果表明，平均加样回收率为99.09%，RSD为1.63%(表2)。

2.2.3 样品含量测定结果 3批样品的含量测定结果见表3。

图4 地黄多糖粉的HPLC色谱图

图5 梓醇的标准曲线

3 讨论

地黄中含有糖类、环烯醚萜苷类、氨基酸、微量元素等多种成分，使得多糖分离纯化过程繁琐、耗时较长，并且用薄层色谱法鉴别多糖也多采用酸水解，对组成多糖的单糖进行鉴别，不具有特征性，较难用薄层快速鉴别[8-9]。一般快速鉴别糖类的方法如Molish也不具有专属性，本研究采用Molish法结合茚三酮显色鉴别地黄多糖，Molish法鉴别药品中含有糖类，薄层法用以鉴别地黄的特征性。其中薄层色谱法的茚三酮显色是鉴别氨基酸，氨基酸成分来自于地黄中微量的氨基酸，也有提取过程中多糖降解，产生的氨基酸类成分。此方法简单快速，辅料对鉴别无干扰，但是属于间接鉴别，考虑到地黄有特征成分梓醇，该项并不列入质量标准项。

表2 梓醇加样回收试验结果

Table 2 Recovery rate of standard addition of catalpol

样品中质量/μgSamplequantity加入质量/μgAddedquantity测得的质量/μgDetectedquantity回收率/%Recoveryrate平均回收率/%MeanrecoveryrateRSD/%11141050214297.9011221050216799.5211121050215399.1411061050212496.9511151050245899.33111310502181101.7199.091.63

表3 含量测定结果

Table 3 Result of content determination

样品Samples总糖含量/%Thecontentoftotalpolysaccharides梓醇含量/%Thecontentofcatalpol2014110465.640.552014101764.240.542014100966.730.54

苯酚硫酸法是常用的测定多糖含量的方法，该方法简单，灵敏度高，试验时基本不受蛋白质存在的影响，但也存在准确性差和重现性低的问题[10-11]。试验要严格控制显色时间、温度，同时用新的苯酚或者重蒸(避免氧化)，且保证所用器皿不含上次试验滞留的颜色，可避免上述问题。

地黄药材中梓醇是其特征成分，但梓醇不稳定，在加工炮制过程中很容易流失，对其进行鉴别和含量测定可有效控制产品质量。本试验中梓醇的鉴别，参照《中国药典》2010年版一部地黄项下的薄层色谱鉴别的方法[12]，在此基础上进行试验和调整，发现改用硫酸甲醇液(1∶9)显色，斑点显色更明显，且有更好的分离效果，较糖类的鉴别，此法专属性更强，更直接，可作为本品的鉴别方法。 HPLC法进行含量测定梓醇时，考虑到梓醇极性较大，本试验尝试用40%、60%、80%、100%的甲醇提取梓醇，发现60%的甲醇提取梓醇，梓醇峰能达到较好的基线分离且峰型好峰面积大。

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Study on Quality Standard ofRehmanniaglutinosaPolysaccharide Powder

SUN Yue-chuan1,ZHENG Hua2,LIU Jing1,WANG Lin1,LIU Ju-xiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding，Hebei， 071000 ，China; 2.AnimalHealthInspectionInstituteofJingxingCounty,Shijiazhuang,Hebei,050300，China)

To establish the quality standard forRehmanniapolysaccharide powder, Molish method and TLC were used to identify. The content of polysaccharides in the powder was determined by phenol-sulfuric acid method and catalpol by HPLC.The coloration of Molish method was obvious.The TLC sports developed were fairly clear. Glucose showed a good linear relationship in the range of 11.1 μg/mL-111 μg/mL (R2=0.994 8),its average recovery rate was 98.74%,and RSD was 2.61%.Catalpol showed a good linear relationship in the range of 10.5 to 105 μg/mL (R2=0.999 2),its average recovery rate was 99.09%,and RSD was 1.17%.This method is simple,accurate and reliable.It can be used as the quality control method.

Rehmanniaglutinosapolysaccharide; catalpol;quality standard; TLC; HPLC

2015-11-05

河北省现代农业产业技术体系蛋鸡产业创新团队项目；石家庄市科技局项目(141490772A)

孙月川(1989-),女,河北唐山人,硕士研究生,主要从事新兽药研发与残留控制研究。*通讯作者

S853.7；S859.3

A

1007-5038(2016)05-0069-05