一起穿山甲疫情的病原分析

陶 立，闫鼎羽 ，李 军*，马春霞，陈泽祥，梁文汇，阙腾程 ，曾 鹏 ，李宝财，杨 威

(1.广西兽医研究所，广西南宁 530001；2. 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001；3. 广西林业科学研究院，广西南宁 530002；4. 广西陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心，广西南宁 530028 )

一起穿山甲疫情的病原分析

陶 立1,2，闫鼎羽3*，李 军1,2*，马春霞1,2，陈泽祥1,2，梁文汇3，阙腾程4，曾 鹏4，李宝财3，杨 威1,2

(1.广西兽医研究所，广西南宁 530001；2. 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001；3. 广西林业科学研究院，广西南宁 530002；4. 广西陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心，广西南宁 530028 )

为了查明一起人工养殖穿山甲疫情的致病原因，应用病毒PCR检测和细菌分离的方法对2只前后病死穿山甲进行病原学检测。病毒PCR检测结果显示，未能从肺组织中检测到流感病毒、副黏病毒和腺病毒核酸。细菌分离结果表明，从2只病死穿山甲肺中各分离到1株优势菌株。细菌的生化试验、16 S rRNA基因的序列分析表明，2株分离菌株均为摩氏摩根菌。小鼠的致病试验和分离菌的药敏试验结果表明，2株分离菌对小鼠有很强的致病作用,对新霉素、壮观霉素、阿米卡星高度敏感。

穿山甲；摩氏摩根菌；分离鉴定；药敏试验

穿山甲为哺乳动物，分类上属于鳞甲目、穿山甲科，全球仅有7～8个种。产于我国的有中华穿山甲(Manispentadactyla)、印度穿山甲(M.crassicaudata)和马来穿山甲(M.javanica)。印度穿山甲和马来穿山甲在我国仅分布于云南的南部地区，而中华穿山甲广泛分布于我国南方的大部分地区和长江流域[1]。由于穿山甲具有重大的食用和药用价值而惨遭猎杀，兼之自然栖息地的破坏，野生种群已濒临灭绝的危险。穿山甲已被《中国濒危动物红皮书》列为易危级(Vu)，是国家二级保护动物，也是我国《野生药材资源保护管理条例》规定保护的野生药材物种之一[2]。保护野生穿山甲种群已刻不容缓，开发穿山甲的经济价值还得走人工养殖的道路，穿山甲对环境条件的要求很高，人工养殖必须要解决3大技术问题，即养殖技术、繁育技术和疾病防控技术。目前国内人工养殖穿山甲成功的例子非常少见，多以失败告终，究其原因是人们对穿山甲在人工养殖状态下的生存需求(包括环境需求)还不甚了解[3]，而穿山甲人工繁育技术和疾病的防控技术更是未有过报道。

广西林业科学院穿山甲养殖中心从救护和人工养殖试验出发，经过多年的探索和实践，在人工养殖技术方面取得了突破，从市场罚没来的穿山甲在该养殖中心救护成活率目前达到40%以上。由于前期天气持续高温，该中心使用空调对养殖环境温度进行调控，加上同期一些外来人员的调研惊动，这些应激因素可能导致了1只中华穿山甲和1只马来穿山甲前后相继发病，病程1个月左右，发病初期精神差，食欲不振，粪便稀少。使用青霉素后不见好转，最终死亡。中华穿山甲死于8月上旬，马来穿山甲死于8月中旬。剖检2只穿山甲均见双侧肺大面积出血肝变，中华穿山甲肝脏还轻度黄染，小肠和大肠黏膜有轻微出血性炎症，大肠内粪便干结，其他脏器均未见肉眼可见病理变化。本文从2只人工饲养的病死穿山甲肺中分离到2株细菌，通过对小鼠的致病性试验，确定了其致病性。利用细菌生化试验和16 S rRNA基因序列分析及系统发育树等方法对2株分离细菌进行鉴定，鉴定为同一种细菌，即摩氏摩根菌，为穿山甲细菌病的防控技术研究提供了参考。穿山甲肺组织上清液经流感病毒、腺病毒和副黏病毒特异性PCR检测均为阴性，说明这起穿山甲疫情为摩氏摩根菌感染所致。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 广西林业科学研究院穿山甲人工养殖中心饲养的病死中华穿山甲和马来穿山甲各1只。中华穿山甲为雄性，2014年1月26日接收，进场时重量3.1 kg, 病前5.8 kg，存活18个月；马来穿山甲为雌性，2015年3月17日接收，进场时重量2.7 kg，病前3.8 kg，存活5个月。昆明系小鼠购自广西医科大学实验动物中心。

1.1.2 试剂和仪器 麦康凯培养基，TSA、TSB购自北京陆桥技术有限责任公司，微量生化反应管及药敏试纸购自杭州天和微生物制剂有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒，分子质量标准3、2×TaqPCR Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；低温台式高速离心机购自Beckman公司；YY2 Ⅲ-8B 稳压稳流型电泳仪购自北京六一仪器厂；Pro Flex PCR System购自Life Tech公司；721BR09310型凝胶成像系统购自Bio-Rad公司；CO2培养箱购自Thermo forma公司。

1.2 方法

1.2.1 取样 分别无菌取中华穿山甲和马来穿山甲的肝、肺、肾及脾织制作触片，革兰染色镜检。

1.2.2 细菌的分离鉴定

1.2.2.1 细菌分离培养和形态观察 分别无菌取中华穿山甲和马来穿山甲的肝、肺、肾及脾组织划线接种麦康凯平板和TSA平板，37℃培养24 h观察优势菌落的形态，取单个的优势细菌进一步纯化，革兰染色观察菌体的形态。纯化的细菌接种TSB液体培养基，观察其在液体中生长状况。

1.2.2.2 细菌分离株生化试验 将细菌分离株纯化后按照参考文献[4]的方法进行。

1.2.2.3 细菌分离株小鼠致病性试验 将分离菌株的TSB 24 h培养液，用无菌TSB稀释成浓度为1×108CFU/mL菌液，腹腔接种试验组小鼠0.4 mL/只，每组5只，对照组5只小鼠直接用无菌TSB液接种，接种量为0.4 mL/只，饲养7 d～10 d，观察发病情况，对死亡小鼠剖检观察脏器的变化，并从中分离致病细菌，鉴定是否与原接种细菌一致。

1.2.2.4 细菌分离株16S rRNA基因测序和分析 挑取分离纯化培养的单个菌落溶解到10μL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，取3 μL菌液作为模板，利用细菌16 S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，反应体系为50 μL：模板3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 26 μL，ddH2O补至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶电泳。胶回收，将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.2.5 药物敏感性试验 采用药敏试纸法，方法按李智红等(2011年)报道的方法[5]进行。

1.2.3 流感病毒、副黏病毒和腺病毒的PCR检测 分别提取穿山甲肺组织的DNA和RNA，应用RT-PCR和PCR检测流感病毒、副黏病毒和腺病毒[6-7]。

2 结果

2.1 镜检结果

在2只穿山甲肺的组织中均发现有革兰阴性的小杆菌；肝、肾和脾组织中未见有细菌。

2.2 细菌分离和鉴定结果

2.2.1 细菌分离株培养及形态特性 从2只穿山甲肺中各分离到1个优势菌株，经纯化后分别命名为Z菌株(分离自中华穿山甲)和G菌株(分离自马来穿山甲)，2株细菌培养和形态特性相一致，在TSA平板上表现为圆形、灰白色隆起，表面湿润，中等大小的菌落，在麦康凯上能生长，为棕色菌落，菌落中心颜色深，在TSB培养基中24 h后，培养基颜色变混浊，试管底有白色沉淀，摇动呈絮状。菌落涂片染色为革兰阴性小杆菌。

2.2.2 Z和G菌株生化试验的结果 按照生化特性试验方法进行生化鉴定，2种菌株结果一致，其生化特性符合东秀珠、蔡妙英主编《常见细菌系统鉴定手册》[8]中摩氏摩根菌的生化特性相一致(表1)。

表1 病原分离株生化特性试验结果

Table 1 The biochemical test results of isolated strains

试验项目Test结果ResultsZG阿拉伯糖Arabinose--葡萄糖Glucose++麦芽糖Maltose--甘露糖Mannose++蔗糖Sucrose--硫化氢H2S--枸椽酸盐Citrate--精氨酸水解酶Ornithinedecarboxylase--赖氨酸脱羧酶Lysinedecarboxylase--鸟氨酸脱羧酶Ornithinedecarboxylase++脲酶Urease++氧化酶Oxidase++过氧化氢酶Catalase++动力Dynamic++吲哚Benzpyrole++MR++VP--山梨醇Sorbitol--甘露醇Mannitol--

注：“+”阳性；“-”阴性。

Note:“+”Positive; “-” Negative.

2.2.3 Z和G菌株对小鼠致病试验结果 Z菌株组和G菌株组的小鼠各5只均于接种后18 h～24 h内相继全部死亡，死亡小鼠肺出血严重，肝肿胀、部分有出血。从死亡小鼠的肝、肺回收到接种菌，对照小鼠在试验期内无异常。

2.2.4 Z和G菌株16 S rRNA序列分析 Z和G菌株经PCR扩增获得约1 400 bp的目的片段(图1)。将PCR产物测序结果表明，2株分离菌株的16 S rRNA核苷酸序列同源性为98.7%，与GenBank上登录的摩氏摩根菌(登录号：AB210972，AF461011，HQ169114，CP004345，KF471511，KF611895)的核苷酸序列同源性达到98.1%～99.5%，序列比对结果表明分离到的2株病原菌均为摩氏摩根菌(表2)。

M. DNA 标准DL 2 000;1.G菌株; 2. F菌株; 3.阴性对照

M. DNA Marker DL 2 000;1.G strain; 2.F strain; 3.Negative control

图1 细菌16 S rRNA PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification results of 16 S rRNA of strains

表2 细菌16 S rRNA 序列核苷酸同源性比较

Table 2 Homology comparison of nucleotide sequences of 16 S rRNA

摩氏摩根菌菌株(登录号)Morganellamorganii(AcessionNo.)Z株/%ZstrainG株/%GstrainSSCT63(AB210972)98.498.2M567(AF461011)99.298.4KT(CP004345)99.598.1FUA1235(HQ169114)98.998.6Cucm(KF471511)99.298.4TMM13033(KF611895)98.998.6

2.2.5 分离菌株药敏试验的结果 2株细菌药敏结果均表现为对新霉素、壮观霉素、阿米卡星高度敏感，对卡那霉素、头孢曲松钠中度敏感，对四环素、克拉霉素、罗红霉素、先锋Ⅵ、先锋Ⅴ、庆大霉素、复方新诺明、诺氟沙星、氯霉素、恩诺沙星、青霉素G、红霉素、头孢噻肟、氨苄西林、强力霉素、链霉素、多黏菌素、林可霉素、头孢夫辛、利福平完全耐药。

2.3 肺组织中流感病毒、副黏病毒和腺病毒的PCR检测结果

检测的结果表明，2只病死穿山甲肺组织中流感病毒、副黏病毒和腺病毒均为阴性。

3 讨论

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)为肠杆菌科的细菌，广泛存在于自然界环境以及人和动物的粪便中，是一种重要的常见条件性致病菌，可感染人引起肺炎、尿道炎、结膜炎、关节炎，甚至败血症状，也可引起伤口感染，还是医院继发性感染的重要病原[9],食用污染摩氏摩根菌的食物也可致人食物中毒[10]。摩氏摩根菌感染多种动物发病并致死亡，表现的症状多为皮肤溃烂，肌肉出血以及肺炎、肝和肾脏的充血、出血等病变。国内多见从发病的黄喉拟龟、鲤鱼、大鲵、鲈鱼、鼋等[11-15]分离到该致病菌，是危害水生动物重要的致病菌之一。赵耘等从患病的袋鼠肝脏中分离致摩氏摩根菌[16]，Zhao等从鸡肝脏组织及分泌物中分离致病原菌，并通过生化试验和16 S rRNA序列检测确定为摩氏摩根菌[17]。本研究从发病的穿山甲的肺中分离到摩氏摩根菌，无论从病原或还是表现出的临床症状与相关报道基本一致。

随着水产和畜牧业的快速发展，养殖方式发生了深刻的变革，同时临床抗生素的大量滥用，导致细菌的耐药性日趋严重。从已报道的摩氏摩根菌药敏试验的情况来看，不同地区不同物种的分离株的耐药情况并不一致，表现出复杂多变的特性。我们这次从穿山甲分离的2株摩氏摩根菌仅对新霉素、壮观霉素、阿米卡星高度敏感，对四环素、先锋Ⅵ、先锋Ⅴ、庆大霉素、复方新诺明等绝大多数抗菌药物耐药。因此，临床用药必须以药敏试验结果为指导，才会收到好的效果。本次疫情中我们及时将敏感药物壮观霉素拌入饲料中连喂3 d～5 d，疫情得到控制，至今没有新的病例发生。

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Pathogenic Analysis of A Disease Epidemic in Pangolins

TAO Li1,2, YAN Ding-yu3, LI Jun1,2, MA Chun-xia1,2, CHEN Ze-xiang1,2, LIANG Wen-hui3,QUE Teng-cheng4,ZENG Peng4, LI Bao-cai3, YANG Wei1,2

(1.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning，Guangxi,530001,China; 2.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology,Nanning，Guangxi,530001,China; 3.GuangxiForestryAcademy,Nanning，Guangxi,530002,China; 4.GuangxiWildlifeRescueandAnimalEndemicDiseaseSurveillance,Nanning,Guangxi, 530028,China)

In order to find out the cause of disease epidemic in raised pangolins, samples from two dead pangolins were detected by bacterial isolation and PCR. Influenza virus, paramyxovirus or adenovirus virus could not be detected by PCR. Two bacterial strains were isolated from lungs of dead pangolins. Biochemical tests, 16 S rRNA sequence analysis of bacteria indicated that both isolates wereMorganellamorganii. Animal pathogenicity test suggested that the two isolates had strong pathogenic effect; while drug sensitivity test showed that both isolates were highly sensitive to neomycin, spectinomycin and amikacin.

pangolin;Morganellamorganii; isolation; drug sensitivity test

2015-10-29

国家林业局部门预算广西项目(No.2015008)

陶 立(1964-)，男，广西全州人，高级兽医师，主要从事动物疫病防治研究。 *通讯作者

S858.9

B

1007-5038(2016)05-0133-04