维生素C对红细胞氧化损伤保护作用研究

李嘉欣，钱多，解彩霞，苏燕*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院检验科，内蒙古包头 014030)

维生素C对红细胞氧化损伤保护作用研究

李嘉欣1，钱 多2，解彩霞1，苏 燕1*

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头市第四医院检验科，内蒙古包头 014030)

为了利用血红蛋白释放试验(HRT)检测生理浓度维生素C(VC)对生理浓度过氧化氢(H2O2)氧化损伤后红细胞的保护作用，用终浓度为0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液处理红细胞悬液并进行HRT。再分别用0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2溶液处理0.4 mmol/L VC作用后红细胞悬液(VC保护组)和VC未作用的红细胞悬液(对照组)，测定红细胞相对溶解度。结果表明，VC达到生理浓度时，血红蛋白再释放量逐渐减弱；VC保护组红细胞相对溶解度与对照组差别不大。说明生理浓度的VC能减弱HRT的血红蛋白再释放，降低红细胞破膜率，但不能显著降低H2O2对细胞膜的氧化损伤。

维生素C；血红蛋白释放试验；过氧化氢;氧化损伤

维生素C(vitamin C, VC)是水溶性抗氧化物。已有研究表明，高浓度VC能够有效维持红细胞的功能和膜的完整性[1]，避免氧化剂对红细胞的损伤。过氧化氢(H2O2)是体内产生的一种活性氧，如果不被及时清除，可以引发红细胞膜脂质过氧化，导致红细胞膜脂质、蛋白质和血红蛋白(hemoglobin，Hb)的结构改变，继而引起红细胞氧化溶血[2]。2007年，本研究组在进行1例轻型β-地中海贫血患者的红细胞电泳过程中偶然发现了Hb再释放现象，依此创建了血红蛋白释放试验(hemoglobin releasing test，HRT)[3-5]，并证实再释放的Hb是与膜结合的Hb[6]。本研究旨在通过HRT检测生理浓度VC作用后Hb再释放变化，探讨生理浓度VC对红细胞膜的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液标本 60份正常成人新鲜肝素抗凝静脉血，取自包头市第四医院检验科的年轻体检者。4℃保存，24 h内检测。

1.1.2 主要仪器与试剂 高速离心机，德国Eppendorf公司产品；全波长多功能酶标仪，美国Thermo公司产品；水平电泳槽(DYY-III型)、稳压稳流电源(DYY-2C)，北京市六一仪器厂产品；17 cm×17 cm玻璃板等。EDTA、30%过氧化氢、硼酸、乙醇、四氯化碳、Tris、淀粉、氨基黑、冰醋酸等均为国产分析纯；琼脂糖，西班牙进口分装；维生素C注射液，0.25 g/mL，瑞阳制药有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 红细胞悬液和溶血液的制备 按照本实验室常规方法制备红细胞悬液和溶血液[7]，分别用终浓度为0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液处理红细胞悬液并进行HRT。再将红细胞悬液分为2组，每组5份。VC保护组加入等体积VC至终浓度为0.4 mmol/L，作用2 h后，两组分别加入0，1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的等体积H2O2作用2 h。

1.2.2 血红蛋白释放试验 按照本实验室常规方法配制淀粉琼脂糖混合凝胶[7]，分别吸取各样品红细胞悬液10 μL加在1 cm×0.2 mm 滤纸条上，再依次插入凝胶，第1次电泳120 V，65 min，断电5 min，120 V再次电泳60 min。泳毕，将胶板浸入氨基黑10 B中染色过夜，次日用50 g/L冰醋酸溶液反复漂洗至背景无色，观察结果并拍照留图。

1.2.3 红细胞相对溶解度 经H2O2处理2 h后的样品以3 000 r/min离心5 min，各取50 μL上清液，用生理盐水稀释6倍，测定540 nm处的吸光度，以溶血液50倍稀释液的吸光度作为参照吸光值，计算各样品的相对溶解度。

1.2.4 统计学处理 数据结果用平均数±标准差表示，采用Graphpad Prism 5.0软件处理，用Two-way Anova检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度VC作用后红细胞悬液的血红蛋白释放比较

随着VC浓度逐渐升高，到达生理浓度(0.3、0.4、0.5 mmol/L)后，红细胞再释放量逐渐减弱，当VC浓度超过生理浓度，达到0.6 mmol/L时，再释放量增多,VC浓度继续升高时，再释放量又呈现降低趋势(图1、图2)。

1～7.0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L维生素C

1-7.0,0.15,0.3,0.4,0.6,0.7,0.85 mmol/L vitamin C

图1 不同浓度VC作用后红细胞悬液的Hb再释放

Fig.1 Hb release of erythrocytes suspension treated by different concentrations of VC

图2 凝胶电泳图谱中释放Hb的半定量分析

2.2 红细胞相对溶解度

2.2.1 参照吸光值 溶血液的50倍稀释液在540 nm处4次测得的吸光值平均值为0.626，以此为参照吸光值。相对溶解度=吸光值/参照吸光值×100%。

2.2.2 不同浓度过氧化氢处理后对红细胞膜的作用 用等体积0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2处理VC保护组和对照组红细胞悬液，结果显示，无H2O2处理时，VC保护组破膜程度低于对照组(P<0.05)，差异显著。随H2O2浓度增大，对照组破膜率虽有增强，但变化不明显；VC保护组破膜率较无H2O2处理时增强(P<0.05)，差异显著，但变化并不随H2O2浓度的增大而改变，也没有明显低于对照组，两组破膜率均在8.5%左右(图3)。

图3 不同浓度H2O2处理红细胞对细胞膜的相对溶解度

3 讨论

红细胞血红蛋白释放试验(HRT)是将未裂解的完整红细胞悬液借助滤纸片加在淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳，电泳过程中进行“通电-断电-再通电”，就会出现Hb的再释放区带。在前期试验中，研究了高浓度VC对氧化损伤红细胞的保护作用，结果显示，高浓度VC对红细胞膜氧化损伤具有保护作用，并能减弱Hb再释放，降低氧化损伤后红细胞的破膜率，发挥了VC对红细胞膜的保护作用[8]。本研究进一步将HRT应用于观察生理浓度VC对红细胞氧化损伤的保护作用。HRT结果表明，当无H2O2存在时，VC浓度到达生理浓度时，能够降低Hb再释放量；生理浓度VC作用后的红细胞悬液的相对溶解度也低于对照组，说明缺乏VC会降低红细胞膜的稳定性，增大破膜率。当VC浓度超过生理浓度继续升高时，Hb再释放量呈现不稳定增高或降低，原因尚不明确，有待于进一步增加样本量进行统计学分析。

机体氧化代谢产生的活性氧包括超氧阴离子(O2-)、H2O2、羟自由基(OH·)、单线态氧(1O2)等[9]。适量的活性氧是细胞信号转导的通路，而过量的活性氧则可导致DNA突变，蛋白质结构和功能的改变，细胞膜脂质的过氧化损害，以致造成机体免疫损伤[10-11]。红细胞内有多种抗氧化成分，包括NADH、NADPH、谷胱甘肽等，它们与VC一起对抗细胞的各种活性氧，保护细胞膜蛋白、Hb和酶蛋白的巯基等不被氧化，从而维持红细胞的正常功能。本研究表明，向红细胞悬液中加入生理浓度范围内的H2O2作用时，VC保护组破膜率与对照组相比并没有明显差别，且与H2O2浓度没有相关性，说明在生理浓度条件下，单纯的添加VC不能明显改变氧化剂对红细胞膜的氧化损伤作用。在红细胞的抗氧化体系中，VC是否与其他抗氧化成分相互作用，提高红细胞自身的抗氧化能力，值得进一步研究。

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Protective Effect of Vitamin C on Oxidative Damage of Erythrocytes

LI Jia-xin1, QIAN Duo2, XIE Cai-xia1, SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China; 2.ClinicalLaboratoryofTheFourthHospitalofBaotou,Baotou，InnerMongolia，014030,China)

In order to use hemoglobin releasing test (HRT) to detect the protective effect of physiological concentration of vitamin C on erythrocytes treated by physiological concentration of hydrogen peroxide (H2O2), The final concentrations of 0, 0.15, 0.3, 0.4, 0.6, 0.7, 0.85 mmol/L vitamin C solution, were used to treat erythrocyte suspensions and HRT was conducted.Then 0, 1.25,2.50,3.75,5.00 mL/L H2O2solutions were used to treat 0.4mmol/L vitamin C treated erythrocyte suspension (vitamin C protection groups) and vitamin C untreated erythrocyte suspension (control groups) respectively,and the relative solubility of erythrocytes was measured.The results showed that the release of hemoglobin decreased gradually when the concentration of vitamin C reached to the physiological level.The relative solubility of erythrocytes in vitamin C protection groups had no significant difference from that of the control groups.It showed that the physiological concentration of vitamin C can decrease the release of hemoglobin by HRT,and decrease the rate of erythrocyte membrane breaking rate,but it can not significantly reduce the oxidative damage of H2O2on the cell membrane.

vitamin C;hemoglobin releasing test;hydrogen peroxide;oxidative damage

2015-10-13

国家自然科学基金项目(81160214)；内蒙古自然科学基金项目(2010BS1101)；内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJZY14265)；秦文斌科技教育基金项目(201309)；内蒙古卫生厅科技计划项目(2010056)

李嘉欣(1982-)，女，辽宁鞍山人，讲师，硕士，主要从事血液保护研究。*通讯作者

S852.21

A

1007-5038(2016)05-0060-03