基于ITS序列分析18个茶树菇菌株的亲缘关系

王洪秀，魏云辉*，靳 亮，胡中娥，李 菁，陈庆隆，李胜杰，钟国祥

(1.江西省农业科学院农业应用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科学院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

基于ITS序列分析18个茶树菇菌株的亲缘关系

王洪秀1，魏云辉1*，靳 亮2，胡中娥1，李 菁1，陈庆隆1，李胜杰1，钟国祥1

(1.江西省农业科学院农业应用微生物研究所, 江西 南昌 330200; 2.江西省科学院微生物研究所, 江西 南昌 330096)

采用ITS 序列分析方法，对供试18株(4株野生菌株、7株工厂化栽培菌株、5株经钴60辐照诱变菌株和2株搭载神十的航天诱变菌株)茶树菇菌株进行研究。结果表明，供试菌种的ITS序列长度为703～721 bp，与GenBank数据库中茶树菇菌种的ITS序列相似度为99 %以上，在种的水平上证明供试菌种为茶树菇。运用构建的系统发育树将供试菌种聚为6个类群，其中Cha3与Cha3shen，AS-2与AS-2-600，AS-1与AS-1shen、AS-1-700，分别聚在了不同的类群，说明这7株茶树菇菌株可能由于辐照或航天诱变后使得ITS序列存在着种内的变异。ITS序列分析结果从系统发育角度反映出了研究菌株的遗传关系，是进行茶树菇菌株遗传分析及科学鉴定的重要工具。

茶树菇；辐照诱变；航天诱变；ITS序列分析

茶树菇(Agrocybeaegerita)隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、粪锈伞科(Bolbitiaceae)、田头菇属(Agrocybe)。野生的茶树菇生长在茶树、杨柳树等腐烂的树木上，分布于中国的福建、云南、浙江及四川等地。由于其生长宿主的多样性及形态上的细微差别，又被命名为杨树菇、柳松茸、柳环菌、柱状田头菇(Agrocybecylindracea)、茶薪菇(Agrocybechaxingu)、油菜菇等[1]。茶树菇因其盖肥柄脆、口味鲜美、营养丰富而被誉为“中华神菇”。含有铁、锌、钙等10多种微量元素，以及人体所需要的17种氨基酸(尤其是人体不能合成的7种氨基酸含量特别高)[2]。有些地方人们还当作药物来治疗胃寒、肾炎水肿等慢性病[3]，近代研究表明茶树菇不仅能抗神经衰弱，而且对高胆固醇及高血脂有一定疗效果[4]，甚至有报道表明茶树菇有一定抗肿瘤功效[5]。长期以来，一方面由于有关茶树菇系统地位的报道较少，导致了命名上的混乱。另一方面，国内外对茶树菇的遗传多样性也鲜有报道[6-11]。因为茶树菇的巨大经济价值，目前在国内很多省份均有栽培。但是同大部分人工栽培食药用菌一样，也面临着品种退化的威胁。因此，从各种环境中搜集野生资源，对现有品种进行诱变驯化，以及对所分离菌株的准确鉴定就愈发显得重要。

真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域，包括内转录间隔区1(ITS1)、5.8S rDNA、内转录间隔区2(ITS2)[12]。在大多数生物中，18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列趋于保守，种间变化较小，作为非编码区的ITS1区和ITS2区，在进化过程中承受较小的自然选择压力，所以相对变化较大，可提供系统学分析所需的详尽的可遗传性状[13]。真菌的rDNA的ITS区段的保守性基本上表现为种内相对一致、种间差异比较明显，这一特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定[14]。许多学者利用不同物种中或同一物种不同菌株间ITS序列的差异来进行真菌系统发育或分类鉴定等方面的研究[15-19]。

本文首次运用ITS序列分析结合碱基比对，对18个供试的茶树菇野生菌株、工厂化栽培菌株、经钴60辐照诱变菌株和航天诱变菌株的ITS序列特征构建指纹图谱，揭示其系统发育关系，为茶树菇的品种选育、资源保护、遗传学研究等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 茶树菇Agrocybeaegerita的18个供试菌株，详见表1。其中4株是野生菌株(编号1～4)、7株是工厂化栽培菌株(编号5～11)、5株是经钴60(剂量为600、700和800 Gy)辐照诱变菌株(编号12～16)、2株是搭载神十的航天诱变菌株(编号17～18)。大肠杆菌Escherichiacoli菌株DH5α由本实验室保存。

表1 茶树菇18个供试菌株

注：1～4：野生菌株；5～11：工厂化栽培菌株；12～16：经钴60(剂量为600、700和800Gy)辐照诱变菌株；17～18：搭载神十的航天诱变菌株。 Note: 1-4: Wild strains; 5-11: Factory cultivation strains; 12-16: Cobalt-60 irradiation induced strains (dose: 600, 700 and 800 Gy); 17-18: Aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft.

1.1.2 主要培养基 PDA培养基制作方法参考方中达[20]的方法，LB培养基参考于飞进和陈卫良[21]的方法。

1.1.3 生化试剂 TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)(北京天根生化科技有限公司)，TaqDNA聚合酶、克隆T载体pMD18-T、dNTP、琼脂糖(大连宝生物工程有限公司)，PCR引物(上海立非生物技术有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养及DNA的提取 接种少量菌丝体到PDA固体培养基上，25 ℃恒温培养至菌丝长满平板。将长满平板的菌丝用灼烧灭菌过的接种铲刮取至1.5 mL的Eppendorf管中，加入液氮研磨至粉状，按照试剂盒使用说明书的方法提取供试材料的DNA，提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 ITS区段通用引物的扩增 选用真菌ITS扩增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[22]，对供试的各个菌株进行ITS区段PCR扩增。反应在25 μl体系中进行，各组分如下：2.5 mmol/L dNTP 2 μl、5 U/μlTaq酶0.2 μl、10 × PCR buffer 2.5 μl、5 μmol/L引物ITS1 1 μl、5 μmol/L引物ITS41 μl、基因组DNA 1 μl，加ddH2O至25 μl。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.2.3 目的片段的克隆与测序 从琼脂糖凝胶上将700 bp左右的ITS扩增条带切下，克隆到pMD18-T载体，用热击法转入大肠杆菌感受态细胞，37 ℃在LB培养基上培养12～16 h，挑取阳性转化子，将LB菌液送交上海立非生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析与系统发育树构建 测得的ITS序列通过BLAST软件进行同源序列比较，选择了与供试菌ITS序列相似度99 %以上的6条序列，以香菇的ITS序列为外类群构建系统发育树[23-25]。采用Clustal X程序进行多序列匹配排列，然后通过MEGA4.0程序中的Neighbor-Joining(NJ)方法、采用Jukes-Cantor计算模型构建系统发育树，进行1000次Bootstrap可信度分析，Kimura 2-parameter法计算遗传距离，空位作为完全缺失(Complete deletion)处理，设置相同的转换(Transition，Ti)和颠换(Transversion，Tv)权重。

M：DL2000 Marker；1～16：不同菌株的PCR产物；CK：对照M: DL2000 Marker; 1-16: PCR products of different isolates; CK: Control图1 茶树菇菌株ITS1/4引物的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of isolates from Agrocybe aegerita with ITS1/4 primers

1.2.5 序列登录号 将本实验中所得到的供试菌株ITS序列提交GenBank登记，序列号如下：KT148846-KT148863。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带清晰(图1)，大小在720 bp左右。

2.2 ITS序列分析

经对位排列，去掉两端不整齐部分得到18株供试菌的ITS比对序列，长度为703～721 bp(表2)，与GenBank数据库中的茶树菇菌种的ITS序列相似度为99 %以上，在种的水平上证明供试菌株为茶树菇。在ITS序列中共有696个保守位点(Conserves sites)，27个变异位点(Variable sites)，9个简约信息位点(Parsimony-informative sites)，18个单个碱基变化位点(Singleton sites)，存在插入与缺失。18株供试菌的ITS序列各碱基含量：A为21.2 %～22.1 %，平均值为21.7 %；T为30.1 %～30.8 %，平均值为30.5 %；G为23.7 %～24.1 %，平均值为23.8 %；C为23.6 %～24.2 %，平均值为23.9 %；G+C为47.4 %～48.2 %，平均值为47.7 %。G+C含量能反映属种间的亲缘关系，含量差异越小，亲缘关系越近。本实验供试菌的G+C含量差异不明显，说明亲缘关系较近[26](表2)。

表2 18个茶树菇菌株ITS序列的序列长度及G+C含量

括号内的数字为GenBank序列号；结点处数字为Bootstrap值；标尺代表2 %的序列分歧Numbers in parenthesis represented GenBank accession No.. Numbers at the branch points indicated the bootstrap values. The scale bar represents a 2 % sequence divergence图2 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

12345678910111213141516171Yangshushang2hao2AS⁃1⁃7000．01013AS⁃10．00720．00874AS⁃1shen0．00570．00720．00145AS⁃2⁃6000．00570．00720．00140．00006AS⁃20．00720．00580．00580．00430．00437Baicha7000．00720．01450．01160．01010．01010．01168Baicha0．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00149Cha3⁃8000．00570．00720．00140．00000．00000．00430．01010．008610Cha30．00860．01010．00430．00290．00290．00720．01300．01150．002911Cha3shen0．00720．00580．00580．00430．00430．00290．01160．01010．00430．007212Cha5⁃8000．00570．01310．01010．00860．00860．01010．00140．00000．00860．01150．010113Cha50．00720．01450．01160．01010．01010．01160．00290．00140．01010．01300．01160．001414Chayuan1hao0．00580．01020．00720．00580．00580．00720．01010．00870．00580．00870．00720．00870．010115Chayuan2hao0．01300．01450．01450．01300．01300．01160．01160．01010．01300．01600．01160．01010．01160．013116Gu10．00720．00580．00290．00430．00430．00290．01160．01010．00430．00720．00290．01010．01160．00720．011617Gu20．00580．01010．01010．00870．00870．00720．01010．00870．00870．01160．00720．00870．01010．00870．01300．007218Yangshudong1hao0．00000．01010．00720．00570．00570．00720．00720．00570．00570．00860．00720．00570．00720．00580．01300．00720．0058

2.3 系统发育分析

采用N-J法构建系统发育树进行系统发育分析(图2)，结果表明,18株茶树菇菌株聚成6个类群：第Ⅰ类群：Yangshushang2hao、Yangshudong1hao；第Ⅱ类群：Cha3-800、Cha3、Chayuan1hao、AS-2-600、AS-1shen；第Ⅲ类群：AS-1、Gu1；第Ⅳ类群：Gu2、AS-2、AS-1-700、Cha3shen；第Ⅴ类群：Baicha700、Cha5-800、Baicha、Cha5；第Ⅵ类群：Chayuan2hao。其中Cha3与Cha3shen，AS-2与AS-2-600，AS-1与AS-1shen、AS-1-700，分别聚在了不同的类群，说明这7株茶树菇菌株可能由于辐照或航天诱变后使得ITS序列存在着种内的变异。系统发育分析中18个菌株聚为6个分支，应视为6个遗传株系，分支间遗传距离较大，可在遗传分支间挑选亲本菌株进行杂交育种，以便充分发挥杂交后代遗传互补优势。

基于Kimura 2-parameter距离模式进行遗传距离分析(表3)，结果表明18株供试菌的成对序列遗传距离范围为0.0000～0.0160，总体平均遗传距离为0.0079，Yangshushang2hao与Yangshudong1hao，Baicha与Cha5-800，Cha3-800与AS-1shen、AS-2-600，以及AS-2-600与AS-1shen，这4组菌间的遗传距离为0，不存在遗传分化，应为相同菌株[27]；余下11株菌种(AS-1-700、AS-1、AS-2、Baicha700、Cha3、Cha3shen、Cha5、Chayuan1hao、Chayuan2hao、Gu1、Gu2)间的遗传距离大于0，存在一定的遗传差距，因此经ITS序列初步分析，将供试的18株菌种定为14个菌。

3 讨 论

由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性；同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度约为300～1000 bp。因此，可以从不太长的序列中获得足够的信息，已受到真菌分类学者的广泛关注。rDNA-ITS序列变异较快，可提供比较丰富的变异位点和信息位点，因此可作为一种分子标记用于探讨真菌种内变异和属内种间分子系统关系[28-31]。近年来，Xiao等利用rDNA-ITS序列提出了冬虫夏草种复合群体及其包含的3个隐存种的假设[32]，曹杰等利用ITS序列分析证明8种鹅膏菌的种间具有较高的遗传多样性[33]。由于ITS序列具有方便、快速的特点，因此也用于鉴定一些未知植株，如侯军等利用ITS序列对疑似菌株白羊肚菌进行了初步分子鉴定[34]，李小林等结合形态学特征观察和ITS序列分析对2株耐高温野生柱状田头菇进行鉴定及系统发育地位的研究[35]。

AS-1、AS-2、Gu1、Gu2、Baicha、Cha5为重要的茶树菇主栽品种，在ITS序列分析中，AS-1和Gu1聚在一个分支，AS-2和Gu2聚在一个分支，Baicha和Cha5聚在一个分支，三者分属不同的遗传分支，系统发育关系较远。栽培中可以将3类菌株搭配种植，以扩大栽培菌株间的遗传背景，利于改良栽培品种结构，提高茶树菇栽培品种对环境、病虫害等因素的适应性。

Cha3与Cha3shen，AS-2与AS-2-600，AS-1与AS-1shen、AS-1-700，分别聚在了不同的类群，说明这7株茶树菇菌株可能由于辐照或航天诱变后使得ITS序列存在着种内的变异。菌株经辐照或航天诱变产生的变异可以改变菌株因长期栽培导致的菌种退化。也可以选择产生有利性状的诱变菌株作为父母本进行杂交，增强后代的杂种优势。

Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao、Chayuan2hao菌株为野生分离菌株，在ITS序列分析中Yangshushang2hao、Yangshudong1hao、Chayuan1hao与Cha3-800、Cha3、AS-2-600、AS-1shen系统发育关系很近。但因其采自野生环境，具有特有的环境适应性、抗逆性等优良特性，能够作为优良亲本菌株在育种中得到较好应用。

在ITS序列分析试验中，获得了18个茶树菇菌株的ITS特征指纹图谱，并被聚为6个分支，反映出了研究菌株的系统发育关系。试验结果从系统发育角度分析得到了研究菌株的遗传关系，其研究结果能够直接应用于进一步的遗传育种和种质鉴定等工作，是进行茶树菇菌株遗传分析及科学鉴定的重要工具。由于受时间和条件限制，研究供试的茶树菇菌株较少，在今后研究中将进一步扩大取样数量和取样范围。

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(责任编辑 李山云)

Analysis on Genetic Relationships of 18AgrocybeaegeritaStrains Based on ITS Sequence

WANG Hong-xiu1, WEI Yun-hui1*, JIN Liang2, HU Zhong-e1, LI Jing1, CHEN Qing-long1, LI Sheng-jie1, ZHONG Guo-xiang1

(1.Institute of Agricultural Applied Microbiology, Jiangxi Agricultural Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330200, China; 2. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096, China)

18 testedAgrocybeaegeritastrains (4 wild strains, 7 factory cultivation strains, 5 Cobalt-60 irradiation induced strains, 2 aerospace mutation strains carried by the Shenzhou 10 spacecraft) by ITS sequence analysis were studied. The results showed that the lengths of ITS sequences ofAgrocybeaegeritastrains were 703-721 bp, and their ITS sequence similarity in the GenBank database was more than 99 %, which indicated that the tested strains wereAgrocybeaegeritaat the specific level. Phylogenetic tree was also constructed that the tested strains were clustered into six groups, of which Cha3 and Cha3shen, AS-2 and AS-2-600, AS-1 and AS-1shen and AS-1-700 were respectively clustered into different groups, which indicated that there were intraspecific variations for ITS sequences of these seven strains under the conditions of irradiation or aerospace mutation. The phylogenetic relationships were distinctly delineated using ITS sequencing, which was an important tool in the genetic analysis and identification ofAgrocybeaegerita.

Agrocybeaegerita; Radiation mutation; Aerospace mutation; ITS sequence analysis

1001-4829(2016)09-2038-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.006

2015-09-10

国家自然科学基金项目(31460490)；中国科学院农业与环境微生物学重点实验室开放研究基金项目(2014AEM003)；江西省青年科学基金项目(20142BAB214021)；南昌市对外科技合作与成果转化推广计划项目(2013HZCG019)；江西省农业科学院创新基金博士启动项目(2012CBS006)

王洪秀(1981-)，女，黑龙江海伦人，博士，主要研究方向为食药用菌遗传育种、资源化利用及栽培技术研究，E-mail:wanghongxiu0624@163.com，Tel：13607045429，*为通讯作者，E-mail:yunhuiwei@sina.com。

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