利用稻瘟病菌粗毒素筛选水稻抗病突变体

刘 艳，迟 铭，王宝祥，宋兆强，杨 波，卢白关，李 健，秦德荣，徐大勇

(江苏徐淮地区连云港农业科学研究所/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏 连云港 222006)

利用稻瘟病菌粗毒素筛选水稻抗病突变体

刘 艳，迟 铭，王宝祥，宋兆强，杨 波，卢白关，李 健，秦德荣，徐大勇*

(江苏徐淮地区连云港农业科学研究所/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏 连云港 222006)

从江苏省稻瘟病不同优势小种菌株的液体培养液中提取稻瘟病菌粗毒素，以本地区较感病中粳稻新品系L119为材料，研究不同稀释浓度粗毒素对水稻种子萌发、成熟胚愈伤组织诱导及分化的影响；在诱导和分化培养基中分别加入适宜的稻瘟病菌粗毒素进行胁迫培养，以获得抗病性有所增强的变异植株。结果表明，种子萌发后胚芽的长度随着粗毒素浓度的提高而降低，在浓度达到1 mL/10 mL时种子萌发完全受到抑制。种胚愈伤组织的生长随着粗毒素浓度的增加受抑制程度逐渐增强，在浓度为25 %时无愈伤产生；愈伤组织在分化时对粗毒素较敏感，在粗毒素浓度为5 % 时分化成苗数急剧下降。对诱导、分化2个阶段双重粗毒素胁迫培养的组培再生植株进行田间抗病性鉴定，抗病性较对照品种有所提高，说明利用稻瘟病菌粗毒素对水稻成熟胚组织的胁迫培养可以诱导愈伤组织的抗病性变异。

水稻；稻瘟病菌；粗毒素；抗病性

稻瘟病(rice blast)是世界各稻区危害最重的一种水稻病害。每年都发病较重，流行性强，严重影响水稻产量，轻则减产，重则颗粒无收。很多农艺性状优良的水稻品种因为抗病性差而无法应用于水稻生产，成为水稻育种中的一个瓶颈。稻瘟病一般采用的化学防治成本高，易造成环境污染且无长期有效的杀菌剂；稻瘟病病原菌小种的遗传多样性和致病性的快速衍变致使抗性品种种植几年后就丧失抗性[1]。长期实践表明，水稻抗稻瘟病品种的选育和利用是避免或减轻该病最经济、最有效、最直接的途径之一。在作物抗病育种的实践中，传统的育种手段和鉴定方法容易受到人为因素的影响和气候条件的限制，周期长，工作量大[2]。随着生物技术的发展，利用离体筛选技术作为获得抗病、耐盐、耐重金属等突变体的重要手段已广泛应用于多种作物。从细胞水平上进行突变体筛选，将生物技术和常规育种技术相结合培育新抗病品种，可从大量细胞中筛选到所需要的个体，且筛选群体大、效率高、时间短、操作简单易行、不涉及安全性问题[3]。

利用病原菌液体培养产生的活性物质(粗毒素)作为选择压力，离体筛选抗病突变体已成为抗病育种的有效途径，在茄子抗黄萎病、苏丹草抗叶斑病、小麦抗赤霉的突变育种研究中已有成功报道[3]。一些研究结果表明稻瘟病粗毒素在水稻稻瘟病害中的作用为致病性因素[4]，用粗毒素接种可产生与病原菌侵染相同或类似的病症[5]，并且具有诱导抗病性活性[6]。相继，高立宏等[7]、杨国涛等[8]、李楠等[2]研究了稻瘟病菌粗毒素对水稲愈伤组织的生长和分化的影响，并经过层层筛选得到了分化苗；但分析分化苗的抗病性仍尚未报道。本研究分析了稻瘟菌粗毒素对水稻种胚诱导分化的影响，并对筛选出的分化苗进行了抗性分析。

1 材料与方法

1.1 稻瘟病菌与水稻品种

稻瘟病菌ZB/ZC/ZD/ZE/ZG1种群及混合孢子悬浮液：由江苏省农业科学院植物保护研究所刘永峰研究员馈赠；水稻品种为抗稻瘟病有待改良的中间品系L119。

1.2 稻瘟病菌粗毒素的制备与毒性鉴定

1.2.1 粗毒素的制备 将混合稻瘟病菌接种于平面扩繁培养基(酵母膏2 g，可溶性淀粉10 g，琼脂15～20 g，定容1000 mL，pH 5.6～6.3)上扩繁，待长出菌丝体并产生孢子后转接到液体培养基(KH2PO4，0.5 g，K2HPO4，0.5 g，MgSO40.5 g，葡萄糖20 g，酵母粉5 g，定溶至1000 mL)中。在25 ℃条件下振荡培养20 d，用无菌纱布滤去菌，离心20 min (1000 r/min)，取上清液进行高温灭菌20 min，所获无菌滤液为稻瘟病菌粗毒素。

1.2.2 种子发芽抑制率试验 取 30 粒萌发一致的种子，均匀地摆在含有粗毒素浓度分别为0.1, 0.5, 1 mL/10 mL 的培养皿中，每个处理重复 3 次，以蒸馏水作为对照。在(20±1)℃发芽箱中培育5 d 后取出。测定种子芽鞘长度，以芽鞘生长的抑制率来评价稻瘟病菌毒素的毒力。

芽抑制率(%)=(1 - 处理芽鞘平均长度/对照芽鞘平均长度)×100 %

1.3 水稻种胚的组织培养

1.3.1 水稻种子的消毒处理 选取籽粒饱满的水稻种子，剥去颖壳后，切取含胚的半粒，在70%的酒精溶液中浸泡30 s，用无菌水冲洗后加入0.2%的升汞溶液消毒7～10 min，然后用无菌水冲洗3～4 次。

1.3.2 粗毒素对种胚愈伤诱导的影响 把经常规消毒过的水稻种子接种于含有不同浓度(0，5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %)稻瘟病菌粗毒素的MS诱导培养基中，每个处理接种 4 瓶，每瓶 12 个，在26 ℃条件下暗培养30 d，统计其诱导率。

1.4 粗毒素对愈伤组织分化成苗能力的影响

将分化能力旺盛的新鲜愈伤组织转入不同浓度(0，5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %)粗毒素的MS分化培养基中，培养25 d 后统计分化成苗数。粗毒素筛选诱导和分化培养基见表1。

1.5 抗稻瘟病变异体的双重胁迫筛选

根据粗毒素对水稻种胚愈伤诱导率的影响，选取粗毒素稀释浓度为20 %的诱导培养基进行愈伤组织的诱导；将胁迫培养诱导出的新鲜愈伤组织转入到含有5 %粗毒素的分化培养基中，获得再生幼苗。

1.6 组培苗移栽与植株抗病性鉴定

1.6.1 组培苗移栽 当组培苗长出 3 至 4 片叶和2至3条根时打开瓶盖，在培养室炼苗2～3 d，移到幼苗培养营养土中培养10 d 后移到试验田中。

1.6.2 植株抗病性鉴定 收获的R1代种子种植后，在孕穗期用稻瘟病菌混合孢子悬浮液进行接种，每株注射1 mL，于水稻成熟后以原品种作对照按调查标准调查结果。穗颈瘟鉴定标准[9]如下，0 级：无病，免疫；1级：1/4 以下枝梗发病或穗颈有斑点，抗病；2 级：1/4 以上枝梗发病或主轴中部发病，或颈部有病，但对产量影响不大，中抗；3级：主轴中部或颈部发病,对产量有显著影响，感病；4级：穗颈发病造成白穗，高感。

表1 愈伤组织诱导与分化筛选培养基

表2 不同粗毒素浓度诱导的愈伤分化成苗能力分析

表3 粗毒素胁迫培养水稻植株的稻瘟病抗性鉴定

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌粗毒素毒力的测定

种子在发芽箱中萌发5 d 后，对照组种子的胚芽平均长度为(2.13±0.13) cm，粗毒素浓度为1 %的种子胚芽鞘平均长度为(1.62±0.17) cm，粗毒素浓度为5 %的种子胚芽鞘平均长度为(0.78±0.15) cm，粗毒素浓度为10 %时种子萌发完全受到抑制。由此可见，随着粗毒素浓度的增加，种子胚芽长度逐渐降低，说明本实验制备的粗毒素具有一定的毒力。

2.2 粗毒素对水稻种胚愈伤组织诱导率的影响

培养基中加入粗毒素对幼胚愈伤诱导有很大的抑制作用, 从图1可看出随着毒素浓度的升高胚性愈伤的诱导率明显下降, 当加入5 %浓度的毒素时, 愈伤的诱导率由对照的91 %降至76 %，下降了15 %；当毒素浓度达到20 %时, 则愈伤的诱导率降至10 %；当毒素浓度大于等于25 %时愈伤组织基本无法正常诱导。由此可见，粗毒素浓度在20 %～25 % 是产生诱导愈伤变异的临界浓度。

2.3 粗毒素对水稻种胚愈伤组织分化成苗的影响

在未加粗毒素的诱导培养基得到的愈伤放入含有不同浓度粗毒素的分化培养基中进行分化成苗，经一段时间的观察发现，随着分化培养基粗毒素浓度的增加, 愈伤出现褐化且没有分化能力的几率提高。从表2可看出，在接入同等愈伤数的分化培养基中，在毒素浓度为5 %时分化出苗能力就明显受到抑制，且在5 %、10 %和15 % 3 个浓度间分化能力无明显差异，在20 %时愈伤无分化成苗能力。

2.4 胁迫培养再生植株的获得及其田间抗病性分析

以上述研究为基础，水稻种胚经粗毒素浓度分别为20 %和5 %的诱导、分化培养基胁迫培养后，获得愈伤分化幼苗，经过室内外炼苗移栽入试验田中获得再生植株。胁迫培养获得的水稻再生植株在孕穗期进行病菌孢子接种鉴定，对鉴定材料的穗茎瘟等级进行评价(表3)。从抗性鉴定结果可看出，在诱导、分化培养基中加入粗毒素胁迫培养得到的水稻植株，其整体抗病性较对照有所提高。

3 讨论与结论

水稻稻瘟病是水稻生产中毁灭性病害，严重制约水稻的生产产量，传统的抗稻瘟病育种研究主要是利用筛选的抗病品种作为亲本与已有的品种进行杂交配组，从中选育抗病新品种，其周期长，工作量较大[10]；通过组织培养途径对水稻抗瘟性进行细胞突变体筛选，将生物技术和常规育种技术相结合培育抗病新品种，其缩短了育种周期，是抗病育种的一种新方法。

图1 种胚在不同粗毒素浓度诱导培养基中的诱导率Fig.1 Induction rate of seed embryo callus in MS media under different concentrations of toxin

据报道，粗毒素与致病菌株之间存在相应的对应关系[5]，粗毒素对水稻的影响与病原菌相似[11]，并且对水稻植株生长特性、细胞结构、相关酶活性以及光系统Ⅱ产生较大影响[11-13]；潘哲超等用低浓度稻瘟菌毒素作为激发子来提高水稻抗性的研究，表明一定浓度的毒素能够作为激发子来诱导水稻的抗性[14]；张君等研究发现稻瘟病菌粗毒素处理水稻幼苗根部后相关病害防卫基因的表达也有所增强[21]。由此，本研究通过分析稻瘟菌粗毒素对水稻种胚愈伤的诱导与分化的影响作用，结果表明粗毒素对愈伤组织的生长抑制作用随浓度的提高呈梯度增强，在20 %～25 %出现了生长转折点，毒素浓度在20 %时种胚的出愈率下降到10 %左右，在25 %时种胚无愈伤诱导出；在愈伤组织分化成苗阶段，粗毒素浓度在5 %时对出苗率就有明显抑制，并且在5 %、10 %和15 %之间出苗数无明显差别，在毒素浓度达到20 %时无分化苗出现。据粗毒素对该品系种胚的抑制影响作用，确定了有利于突变体产生的组织培养诱导和分化培养基中粗毒素浓度胁迫的最佳浓度，进行了抗病突变体的筛选，最终得到5株抗病性比对照品种较高的突变体再生植株。但不同的水稻品种对稻瘟病的抗病性存在差异，在粗毒素作用下进行胁迫培养时也存在着差异性[7-8]，因此在进行抗稻瘟病筛选时，特别是在诱导阶段粗毒素临界浓度的选择应和品种的抗性相对应。针对本实验筛选出的抗病变异株，其抗病性产生的抗性机理有待进一步深入研究，为稻瘟菌毒素诱导产生抗性突变体提供研究基础。

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(责任编辑 陈 虹)

Anti-Blast Mutant Screened from Tissue Cultured with Crude Toxin fromPyriculariaoryzae

LIU Yan, CHI Ming, WANG Bao-xiang, SONG Zhao-qiang, YANG Bo, LU Bai-guan, LI Jian, QIN De-rong, XU Da-yong*

(Lianyungang Agriculture Science Institute/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Corp Production, Jiangsu Lianyungang 222006, China)

The crude toxin was extracted from liquid of different Jiangsu province’s physiological races of rice blast fungus, the local rice variety which was sensitive to rice blast was chosen as tested material. The effects of crude toxin on its seed germination, mature embryo callus’s growth and differentiation were studied. Under appropriate concentrations of crude toxin, the blast-resistant mutant during the whole time of embryo callus’s growth was screen out. The results showed that the seeds’ germination was inhibited strongly with the increasing of the toxin concentration, and the germination was totally inhibited when the concentration was 1 mL/10mL. The growth of embryo callus was inhibited gradually with the increasing of toxin’s concentration, and the callus’s growth was completely stopped when the concentration was 25 %. The differentiation of embryo callus was sensitive to toxin, and the differentiation rate of seedling was dropped significantly when the concentration was 5 %. The rice seedlings from the mature embryo cultured with crude toxin were injected by rice blast fungus in the field, their disease resistance was improved compared with CK. This study suggested that the method of using the media including toxin to induct mutant was a effective protocol to improve the rice resistance of rice-blast.

Rice;Pyriculariaoryzae; Crude toxin; Rice blast resistance

1001-4829(2016)09-2016-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.002

2015-09-24

连云港市现代农业项目“中粳水稻品种抗稻瘟病资源遗传分析及种质创新”(CN1502); 连云港市科技攻关项目“利用分子标记聚合育种技术改良水稻品种抗病性”(CN1415)；江苏省科技支撑计划“优质多抗超高产中粳稻新品种选育”(BE2014314)；国家水稻产业体系“推进粳稻生产关键技术研究与示范”(CARS-01-01A)

刘 艳(1982-)，女，山西高平人，博士，主要研究方向：水稻育种，E-mail:ly516.bester@163.com，Tel：15996112982，*为通讯作者：徐大勇，E-mail:xudayong3030@sina. com。

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