类重金属ATP酶基因序列遗传变异分析

李程鹏, 孙一丁, 刘 辉, 曾千春, 王炎炎, 马继琼,杨 奕, 许明辉 *

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室， 农业部西南作物基因资源与种质创新重点实验室,云南 昆明 650223；3.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223)

类重金属ATP酶基因序列遗传变异分析

李程鹏1, 孙一丁2, 刘 辉3, 曾千春1, 王炎炎2, 马继琼2,杨 奕2, 许明辉2 *

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省农业生物技术重点实验室， 农业部西南作物基因资源与种质创新重点实验室,云南 昆明 650223；3.中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650223)

OsHMA2 是水稻根和地上部一个主要的Zn和Cd的转运蛋白，在水稻基因组OsHMA2位点存在OsHMA2类似基因OsHMA2-like，编码蛋白包含水稻P1B型ATP酶重金属转运蛋白的功能域。对来自世界不同稻区的27份亚洲栽培稻和8份野生稻基因OsHMA2-like编码区序列进行了测序分析，以了解水稻OsHMA2-like序列的多样性,为发掘基因资源提供信息。OsHMA2-like核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,在 471 bp 的编码序列内发现了6个变异位点；Tajima'sD检验表明均不显著，说明这些位点属中性进化状态；6个变异位点中，第15、78、132、214、417位点碱基不引起氨基酸的变异，而第457位的变异使得5个供试材料(1个O.nivara，4个ARO品种和1个粳稻品种)由于提前形成终止子在C末端少3个氨基酸，ARO类品种在此位点上与TRJ、IND、TEJ存在显著差异，这暗示ARO类品种可能由O.nivara演化而来。

亚洲栽培稻；野生稻；OsHMA2-like基因；进化

锌是生物生长和发育的一种重要的金属营养元素。300多个酶的辅因子的形成都需要锌离子的参与[1]而且它在稳定蛋白质的结构中起着非常关键的作用[2-3]。缺锌已对人类的健康造成很大的威胁，据官方统计，超过全世界25 %的人口受到了缺锌的影响[4]。在植物中，锌在许多生化过程中扮演着非常重要的角色。锌缺乏时植物的生长会受到严重影响，然而，过量锌又会在植物体内产生毒性物质。因此在植物中,锌的吸收和运输必须受到严格的控制和调控。

镉是一种有毒重金属[5]。镉作为第一类致癌物质通过食物链在人体内不断的积累会导致严重的健康问题[6]。水稻是亚洲人的主要粮食作物，来自水稻谷粒中镉的含量越来越受到人们的密切关注[7-11]。

在众多的金属转运蛋白家族中，P1B型ATP酶重金属转运蛋白(HMAs)，广泛存在于低等和高等植物中，参与植物生长发育过程中所必需的微量金属营养元素的吸收、运输与积累[12-13]。根据它们转运底物的不同，HMAs被分为2个亚类，即铜/银组和锌/钴/ 镉 /铅组[14]。

水稻中共有9个HMA基因。OsHMA1-3属于Zn/Co/Cd/Pb类,而OsHMA4-9属于Cu/Ag类。OsHMA3在水稻的根细胞中将Cd转运到液泡中,行使Cd解毒功能[15-16]。OsHMA9属于Cu/Ag子类，定位在细胞质膜上，参与重金属从细胞质向细胞外的运输[17]。OsHMA2具有锌/镉 /铅底物特异性，它不仅参与Zn+的运输，也参与Cd2+的解毒过程[18-19]。OsHMA2定位在细胞质膜上，能将Zn+和Cd2+排出细胞外。OsHMA2主要在水稻根部的维管束中表达，当锌缺乏时会降低OsHMA2在根部的表达量[20]。这些结果表明，OsHMA2在锌和镉卸载到木质部的过程中起作用，并参与这些金属从地下部到地上部的运输。对花序形成过程中及种子成熟阶段的锌运输也起到作用[21]。

在水稻基因组OsHMA2位点上，存在P1B型ATP酶重金属转运蛋白(HMAs)类似基因(OsHMA2-like),OsHMA2-like编码P1B型ATP酶重金属转运蛋白(HMAs)，蛋白序列比重金属ATP酶2(OsHMA2)短得多，但也包含由30多个氨基酸组成的HMA结构域和位于N-端和C-端金属结合位点MBD。OsHMA2-like基因包含2个外显子和1个内含子，编码区序列长度为471 bp(http://www.ricedata.cn/gene/list/1948.htm)。

目前对OsHMA2-like的研究很少，文章对来自世界不同稻区的27份亚洲栽培稻和8份野生稻基因OsHMA2-like编码区序列进行了分析，以了解水稻自然群体中OsHMA2-like序列的多态性,为加深OsHMA2-like的进化、调节镉和锌离子运输机制的研究和找寻水稻群体中对Cd2+高效解毒的OsHMA2-like等位基因提供信息。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料包括27份亚洲栽培稻品种和8份野生稻，来自亚洲稻作主要分布国家，具有一定的多样性(表1), 27份栽培稻中包含热带粳稻(TRJ )9个， 温带粳稻(TEJ)6个，香稻(ARO)4个，籼稻(IND)8个；8份野生稻包括3份O.nivara，5份O.rufipogon。Xu[22]等人对这些材料已进行了重测序，以日本晴为测序对照品种。

1.2 OsHMA2-like基因同源序列的获取及分析

OsHMA2-like基因位于第6染色体 30,354,951——30,357,907,35份材料同源序列用软件Editplus v3.40,序列用软件DNASTAR V7.10进行比对。根据Neighbor-joining法，用软件MEGA V5.10构建系统进化树[23]。

1.3 核苷酸多态性分析

根据Rozas的方法，用软件DnaSP v5.10 .01来分析核苷酸多态性[24]，并进行S(多态性位点数量)，p(核酸多态性)，θ(Watson核酸位点多样性)，Tajima’sD(中性检测统计学数据)，P(当数据P<0.05，表示Tajima’sD数据显著)的计算。

表1 供试材料

续表1 Continued table 1

标记Label材料名称Nameofaccessions编号Plantidentification材料类型Status材料来源Origin材料类群VarietygroupIRGC55471＿TEJChodongjiIRGC55471LandraceSouthKoreaTEJIRGC8191＿TEJMansakuIRGC8191LandraceJapanTEJIRGC11010＿TRJMaintmolotsyIRGC11010EliteMadagascarTRJIRGC328＿TRJAZUCENAIRGC328LandracePhilippinesTRJIRGC38698＿TRJNPE844IRGC38698LandracePakistanTRJIRGC43675＿TRJTrembeseIRGC43675LandraceIndonesia(EastJava)TRJIRGC43397＿TRJGotakGatikIRGC43397LandraceIndonesia(C．Java)TRJIRGC50448＿TRJCanellaDeFerroIRGC50448EliteBrazilTRJIRGC66756＿TRJLemontIRGC66756EliteTX，USATRJIRGC8244＿TRJDavaoIRGC8244LandracePhilippinesTRJIRGC106105⁃nivaraMV89⁃80IRGC106105wildriceMedinipur，IndianivaraP46＿rufipogonP46P46wildriceHainan，ChinarufipogonYJ＿rufipogonYuan3⁃9Yuan3⁃9wildriceYunnan，ChinarufipogonIRGC9148＿INDTD2IRGC9148EliteThailandINDIRGC105958＿rufipogonPADIPADIANIRGC105958wildriceKromatWatu，IndonesiarufipogonIRGC105960＿rufipogonDALDHANIRGC105960wildriceChakaria，BangladeshrufipogonVOC4＿rufipogonVOC4VOC4wildriceNepalrufipogonIRGC89215⁃nivaraCA97⁃053IRGC89215wildriceSopoirTep，CambodianivaraIRGC32399＿TEJPhudugeyIRGC32399LandraceBhutanTEJIRGC12793＿AROKitrana508IRGC12793EliteMadagascarAROIRGC43325＿TRJAriasIRGC43325LandraceIndonesia(WestJava)TRJIRGC9060＿AROJC101IRGC9060EliteIndiaAROIRGC9062＿AROJC111IRGC9062EliteIndiaARORA4952＿AROFiroozRA4952LandraceIranAROIRGC106154⁃nivaraL89⁃12IRGC106154wildriceVientiane，Laosnivara

2 结果与分析

2.1 OsHMA2-like编码区序列分析

在所有研究材料中, ATP酶重金属转运蛋白OsHMA2-like基因的编码区长度为471 bp。该范围内发现6个变异位点，分别位于15,78,132,214,417,457位(表2)。 位点214处的突变频率最高，为31.4 %，其余位点的突变频率在15 %～25 %。位点78,132,214处的碱基替换在栽培稻和野生稻中均有发生，而位点15,417,457处的变异只发生在栽培稻和nivara中。

35个供试材料中,分别有1～6个位点发生碱基替换(表3)。位点15处的变异发生在ARO，TEJ，和nivara中。位点78处的变异发生在ARO，TEJ和2种野生稻中。位点132处的变异在ARO，IND和2种野生稻中发现。在粳稻中位点15,78，417,457处的变异被发现，而籼稻只在位点132，214处发生变异。TEJ和 TRJ发生变异的位点存在明显差异。

表2 OsHMA2-like基因编码区序列的变异

表3 OsHMA2-like基因的不同单倍型

注：“-”代表在此位点上与日本晴相同。

Notes: ‘-’ represented that this locus was the same with Nipponbare.

2.2 单倍型分析

通过序列比对，OsHMA2-like基因的编码区存在10种不同的单倍型(H)(表4)，其中日本晴属于单倍型H1。从表4可以看出, 大多数的 TEJ(83.3 %) ，TRJ(88.9 %)和IND(87.5 %)归为单倍型H1，同时有1个nivara和2个rufipogon也归入该单倍型；H1～H9单倍型仅各出现1个材料，其中H2为IND 所特有，H3，H4，H5为O.rufipogon特有，H6为nivara特有，H7为TEJ特有，H8为ARO特有，H9为TRJ特有；H10为ARO和nivara共有。

2.3 Tajima's D检验

用DNASP软件对OsHMA2-like等位基因编码区的核苷酸多态性分析表明，在6个变异位点中，栽培稻和野生稻都发生变异(表5)，野生稻中的p和T值均高于栽培稻，在栽培稻中，温带粳稻 TEJ的p和T值较高，而TRJ， IND和 ARO中的p和T值较低，Tajima'sD检验表明，Tajima'sD值均不显著。

表4 不同单倍型在各水稻类群中的分布

表5 OsHMA2-like 等位基因的核苷酸多态性分析

2.4 氨基酸变异分析

对OsHMA2-like10个单倍型所编码的氨基酸序列进行分析表明，其中有 1 个多态性位点使得供试材料中的1个Oryza.nivara，4个ARO和1TRJ品种由于提前形成终止子在C末端少3个氨基酸,其余的氨基酸序列完全相同(图1)。

2.5 进化树构建

为检测35个材料之间的亲缘关系，根据它们的核苷酸序列建立进化树(图2)。35份材料分为二大枝，其中所有的野生稻O.rufipogon、TRJ、IND、大部分TEJ归为I枝，所有的ARO和2个nivara、1个TEJ归为II枝。可见ARO类品种在此位点上与TRJ、IND、TEJ存在显著差异。

3 讨 论

水稻基因组测序分析显示, 分布于整个基因组单核苷酸多态性(SNPs)非常丰富[25-28]。该研究中，在OsHMA2-like编码区共发现6个变异位点，分别位于15,78,132,214,417,457位，OsHMA2-like基因的编码区存在10种不同的单倍型(H)，籼稻和粳稻存在共享基因型，无明显分化，而 ARO与籼稻和粳稻在此位点上存在明显的分化。

图1 OsHMA2-like等位基因的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of OsHMA2-like alleles

图2 Neighbor-joining 法构建水稻过氧化物酶基因OsHMA2-like系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree constructed with the nucleotide sequences of OsHMA2-like genes from 40 rice accessions by Neighbor-joining

OsHMA2-like作为未来作物育种中一个重要的靶基因，特定位点在基因发挥功能中起着非常重要的作用,在自然界可能存在能对Cd2+高效解毒的OsHMA2-like等位基因,因此鉴定自然群体中该基因的等位变异, 有可能筛选到相应的OsHMA2-like等位基因。在本研究中，发现一种ARO和O.nivara共有的OsHMA2-like新的单倍型，由于提前形成终止子在编码蛋白C末端少3个氨基酸，这暗示ARO可能由O.nivara演化而来。

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(责任编辑 王家银)

Genetic Variation Analysis of Heavy Metal ATPase-Like Gene in Rice

LI Cheng-peng1, SUN Yi-ding2, LIU Hui3, ZENG Qian-chun1,WANG Yan-yan2, MA Ji-qiong2, YANG Yi2, XU Ming-hui2 *

(1.College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650205, China；2.Key Laboratory of Biotechnology Research of Yunnan Province, Key Lab of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture, Institute of Biotechnology and Genetic Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650223, China；3. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

OsHMA2 was a major zinc and Cd transporter in the root and aboveground of rice,OsHMA2 loci in the rice genome existed a similar gene,OsHMA2-like, containing the functional domain of heavy metal transport protein. The variations ofOsHMA2-likein 35 rice accessions from different areas of the world including 27 ofOryzasativaand 8 accessions of wild rice relatives were analyzed using resequenced ORF sequences in order to understand the riceOsHMA2-likesequence diversity and provide information for genetic resources. The nucleotide sequence and amino acid sequence analysis ofOsHMA2-likeshowed that there were six mutation loci in 471 bp coding sequence. The Tajima'sDvalues of the total group and all subgroups suggested that theOsHMA2-likealleles belonged to neutral selection in rice. Interestingly the 15th, 78th, 132th, 214th, 132th mutation didn’t cause the variation of amino acids, and the 457th mutation led to a elimination of three amino acids in 5 accessions, ARO existed significant difference on these sites compared to TRJ, IND and TEJ, which suggested that ARO was bred byO.nivara.

Oryzasativa; Wild rice; GeneOsHMA2-like; Evolution

1001-4829(2016)09-2009-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.001

2014-04-15

国家自然科学基金“抗稻瘟病基因Pid2进化与专化抗性分子机制研究”(31360331)；科技部基础性工作专项“贵州农业生物资源调查”(2012FY110200)；云南省自然科学基金“云南地方稻种Pi-d2同源基因序列及专化抗性分子机制研究”(2013FZ146)

李程鹏(1987-)，男，硕士，研究方向为生化与分子生物学，E-mail：xuminghuiynnky@163.com，*为通讯作者，E-mail: xuminhui@sohu.com。

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