重症肌无力患者血清Titin抗体和RyR抗体的临床研究

戴俊杰 曾庆意 丁美萍

重症肌无力患者血清Titin抗体和RyR抗体的临床研究

戴俊杰 曾庆意 丁美萍

目的 探讨重症肌无力（MG）患者血清Titin抗体和Ryanodine受体（RyR）抗体的临床意义。方法 采用ELISA法检测61例MG患者和35例健康体验者（正常对照组）的血清Titin抗体、RyR抗体、AChR抗体。结果 MG组Titin抗体和RyR抗体阳性率均显著高于对照组（均P＜0.001）；合并胸腺瘤MG（MGT）组患者Titin抗体阳性率明显高于未合并胸腺瘤MG（NTMG）组（P＜0.01）；MGT组和NTMG组患者RyR抗体阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）；晚发型MG患者中Titin抗体和RyR抗体阳性率均明显高于早发型MG患者（均P＜0.05）；全身型或重症型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）Titin抗体阳性率显著高于眼肌型（Ⅰ型）（P＜0.01），而两组间RyR抗体阳性率未见统计学差异（P＞0.05）；MG患者Titin抗体和RyR抗体水平与肌无力严重程度相关分析呈正相关（r=0.520、0.487，均P＜0.01）。结论 Titin抗体和RyR抗体检测有助于MG的诊断，且Titin抗体有助于鉴别MG患者是否伴随胸腺瘤及进行Osserman分型。Titin抗体与RyR抗体水平还与MG患者病情的严重程度相关，可应用于评估MG患者的病情与预后。

重症肌无力 Titin抗体 RyR抗体 胸腺瘤

【 Abstract】 Objective To investigate serum Titin antibody and Ryanodine receptor(RyR)antibody levels in patients with myasthenia gravis(MG)and their clinical significance. Methods Serum Titin antibody and RyR antibody were detected with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in 61 MG patients(MG group)and 35 healthy subjects (control group). Results The positive rates of Titin antibody and RyR antibody were 62.3%and 49.2%in MG group,those in control group were 11.4%and 8.6%(both P＜0.001).The positive rates of Titin antibody in MG patients with thymoma(MGT）was significantly higher than that in those without thymoma(NTMG)(P＜0.01).There was no significant difference in RyR antibody positive rate between MGT group and NTMG group(P＞0.05).The positive rates of Titin antibody(80.0%)and RyR antibody (63.3%)were higher in late-onset MG patients than those in early-onset MG patients(both P＜0.05).The positive rate of serum Titin antibody in generalized or severe MG patients(ⅡA,ⅡB,Ⅲ,Ⅳtype)was significantly higher than that in ocular MG (I type)patients(P＜0.01),while no significant difference was observed in positive rate of RyR antibody(P＞0.05).In MG patients,the level of Titin antibody and RyR antibody was positively correlated with the severity of muscle weakness (r=0.520 and 0.487,both P＜0.001). Conclusion Serum Titin antibody and/or RyR antibody levels may be of value in diagnosis of MG and the severity of the disease.In addition,Titin antibody may distinguish MGT from NTMG and Osserman calssification.

重症肌无力（MG）是由乙酰胆碱受体（AChR）抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与的主要累及神经-肌肉接头传递障碍的一种获得性自身免疫性疾病。AChR抗体阳性有助于诊断MG，但临床上有20%～40%MG患者血清AChR抗体为阴性[1]。因此目前认为MG发病机制中，除AChR抗体外，还有多种自身抗体存在，如连接素（Titin）抗体、Ryanodine受体（RyR）抗体、肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体等[2]。笔者采用ELISA法检测MG患者及正常健康者血清中Titin抗体及RyR抗体，探讨Titin抗体和RyR抗体在MG诊断、年龄分类、合并胸腺瘤与否、Osserman分型、肌无力严重程度评估中的临床意义，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集宁波市李惠利医院2011年10月至2013年5月诊治的61例MG患者，依据典型临床表现、新斯的明试验、重复神经电刺激、血清AChR抗体测定、胸腺CT等检查确诊。其中男24例，女37例；年龄14～81岁,平均49.1岁；早发型（发病年龄≤50岁）31例，晚发型（发病年龄＞50岁）30例；接受手术治疗30例，其中病理检查证实胸腺瘤者24例，胸腺增生者6例，其余31例MG患者均经胸部CT证实（除外胸腺病变）。Osserman分型Ⅰ型19例，ⅡA型12例，ⅡB型22例，Ⅲ型5例，Ⅳ型3例，并按改良Oosterhuis 5分评定法评定肌无力严重程度，其中1分者19例，2分者12例，3分者22例，4分者8例，5分者0例。选择同期宁波市李惠利医院健康体检者35例作为正常对照组，均为排除神经系统及自身免疫系统疾病，其中男14例，女21例；年龄19～74岁，平均47.2岁。两组患者年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法 两组患者均于清晨空腹抽取静脉全血4ml，分离血清，冻存于-20℃冰箱待检。采用美国RB试剂公司生产的人Titin抗体试剂盒和人RyR抗体试剂盒以及源叶生物科技有限公司生产的人AChR抗体试剂盒，严格按照说明书采用ELISA进行检测。设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。样品孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔注入洗液350μl，浸泡1min，用洗板机洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μl，15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样品浓度值。Titin抗体和RyR抗体阳性结果判断：以大于正常对照组所测浓度值的均值加上2倍的标准差为抗体阳性判断阈值。＞23.14pmol/ml判断为Titin抗体阳性，＞42.15U/L判断为RyR抗体阳性，AChR抗体阳性结果判断：以＞S 2.5标准品浓度（120pmol/L）判断为AChR抗体阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件，各组抗体阳性率比较采用χ2检验，抗体水平与肌无力严重程度的关系采用Spearman秩相关分析，一致性比较采用配对χ2检验。

2 结果

2.1 不同组别Titin抗体和RyR抗体阳性率的比较 MG组 Titin抗体阳性率为 62.3%，RyR抗体阳性率为49.2%；正常对照组中Titin抗体阳性率为11.4%，RyR抗体阳性率为8.6%，MG组两种抗体的阳性率均高于对照组（均P＜0.001）。晚发型MG患者中Titin、RyR抗体阳性率高于早发型（均P＜0.01）。合并胸腺瘤MG（MGT）患者Titin抗体阳性率高于未合并胸腺瘤MG（NTMG）患者（P＜0.01）；MGT与NTMG组患者RyR抗体阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。全身型或重症型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）MG患者Titin抗体的阳性率高于眼肌型（Ⅰ型）MG患者（P＜0.01）。眼肌型患者RyR抗体阳性率相较于全身型或重症型比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

2.2 Titin抗体及RyR抗体水平与肌无力严重程度评估 根据改良Oosterhuis5分法评定MG患者肌无力严重程度分为1、2、3、4分共4个组别，结果发现Titin抗体、RyR抗体水平与肌无力严重程度均呈正相关（r= 0.520、0.487，均P＜0.001），详见表2。

2.3MG患者AChR抗体、Titin抗体及RyR抗体一致性比较 MG患者AChR抗体、Titin抗体及RyR抗体阳性结果一致性比较显示AChR抗体与Titin抗体AChR抗体与RyR抗体均未见显著一致性关系，而Titin抗体与RyR抗体之间存在一定的一致性，但其吻合度较差，详见表3～5。

3 讨论

MG是一种自身免疫性疾病，除已明确的AChR抗体外，部分MG患者血清中还有Titin抗体及RyR抗体[2]。Titin抗体主要针对连接素分子上位于A/I带交界处主要免疫原性区cDNA序列所表达的MGT-30分子，影响肌小结的收缩，导致肌无力的发生[3]。RyR是一种跨膜型的钙通道蛋白质，其功能区域在钙离子释放及骨骼肌兴奋收缩藕联中起作用，RyR抗体影响了RyR钙的释放，使骨骼肌不能有效收缩，从而产生肌无力的症状[4]。本研究发现AchR抗体与Titin抗体及RyR抗体检测结果未见显著一致性，这也进一步提示Titin抗体和RyR抗体作为抗骨骼肌抗体与AchR抗体作用机制存在不同。

本实验研究结果显示，在MG组中阳性率高达62.3%，显著高于正常对照组（11.4%），而RyR抗体在MG组阳性率也高达49.2%，同样明显高于对照组（8.6%）。国内王巍炜等[5]通过对89例患者进行MG相关抗体研究发现Titin抗体和RyR抗体的阳件率分别为64.0%和55.0%。本组数据与国内同类研究[5]相近。Titin抗体和RyR抗体在MG患者中的高表达，提示两种抗体均可作为诊断MG的一种辅助指标。

表1 不同组别Titin抗体和RyR抗体阳性率的比较

表2 不同肌无力严重程度组别Titin抗体和RyR抗体浓度及相关性分析

表3 MG患者AChR抗体与Titin抗体一致性比较

表4 MG患者AChR抗体与RyR抗体一致性比较

表5 MG患者Titin抗体与RyR抗体一致性比较

有研究发现随着年龄的增长，Titin抗体和RyR抗体阳性率逐渐增高[6]。本研究中晚发型MG患者两种抗体的阳性率（分别为80.0%和63.3%）明显高于早发型MG患者（分别为45.2%和35.5%），提示Titin抗体和RyR抗体阳性多见于晚发型MG患者。国内外Suzuki[7]、王巍炜等[5]研究也显示了一致性。

本实验研究结果发现在MGT患者中，Titin抗体的阳性率为83.3%，NTMG患者中阳性率为48.6%，这提示Titin抗体对MGT诊断有较高的敏感性。国内学者的研究也显示了一致性，高枫等[8]报道Titin抗体可出现于80%的MGT患者血清。本研究显示在MGT患者中，RyR抗体阳性率为58.3%，相较于NTMG患者（43.2%）无统计学差异。Takamori[9]报道约50%MGT患者体内存在RyR抗体，本研究数据与其基本相当。而Suzuki等[3]及阎志慧等[10]研究发现在MGT患者中RyR抗体的阳性率为70%～80%，且与NTMG患者相比阳性率显著增高（据其研究数据[10]分析所得），以上发现与本研究的结果出入原因可能为本研究并未对所有MG患者进行胸腺病理活检，只通过CT对胸腺病变进行排除，而CT对胸腺病变诊断的假阴性率将近20%[11]，假设MGT患者RyR抗体的阳性率高于NTMG患者，本研究分类中NTMG患者中若掺杂MGT患者，则可能导致本研究结果MGT患者RyR抗体阳性率偏低，且未能显著高于NTMG患者。已有实验发现Titin抗体和RyR抗体均多见于MGT和晚发型MG患者[6]，且本研究一致性检验发现MG患者中这两种抗体检测结果存在一定的一致性，提示两种抗体的产生可能有共同的机制。由此可推断MGT患者两种抗体阳性率可能均显著高于NTMG患者，两种抗体可协助鉴别是否合并胸腺瘤。

结合Osserman分型，本研究显示与RyR抗体不同，全身型或重症型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）MG患者Titin抗体的阳性率高于眼肌型（Ⅰ型）MG患者。这与朱殊等[12]研究结果相同，提示Titin抗体对MG患者分型有一定帮助。

本研究结果显示MG患者血清Titin抗体和RyR抗体检测值与肌无力严重程度评分正相关，病情程度越严重的患者，其Titin抗体和RyR抗体吸光度值越高，说明Titin抗体和RyR抗体水平均可作为评价MG严重程度的一个客观指标。阎志慧等[13]报道10例行胸腺手术的MG患者术后复查Titin抗体，发现Titin抗体水平较术前显著下降，肌无力症状亦明显减轻。李延峰等[14]通过对74例患者进行MG相关抗体研究发现，RyR抗体阳性MG患者临床症状较重，且RyR抗体滴度与MG患者病情严重程度相关。因此，Titin抗体和RyR抗体都可以作为MG患者病情严重程度以及预后评价的指标，但具体的肌无力评分对应的抗体滴度水平设定仍需要更大样本的研究进行确定。

综上所述，血清Titin抗体和RyR抗体对MG有重要的临床应用价值，可作为诊断MG的一种辅助指标。Titin抗体有助于鉴别MG患者是否伴随胸腺瘤及进行Osserman分型以区分全身型或重症型与眼肌型MG患者。Titin抗体与RyR抗体水平还与MG患者病情的严重程度相关，可应用于评估MG患者的病情与预后。

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（本文编辑：严玮雯）

《浙江医学》对图表的要求

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本刊编辑部

Serum Titin antibody and Ryanodine receptor antibody in patients with myasthenia gravis

DAI Junjie，ZENG Qingyi,DING Meiping. Department of Neurology,Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China

Myasthenia gravis Titin antibody RyR antibody Thymoma

2015-12-24）

315040 宁波市医疗中心李惠利医院神经内科（戴俊杰，曾庆意）；浙江大学医学院附属第二医院神经内科（丁美萍）

戴俊杰，E-mail：daijunjielove@126.com