肝动脉插管化疗栓塞后肝癌HIF3α的表达与患者临床病理特征及新生微血管密度的相关性

张晓岚 龚卉

肝动脉插管化疗栓塞后肝癌HIF3α的表达与患者临床病理特征及新生微血管密度的相关性

张晓岚 龚卉

目的 探讨肝动脉插管化疗栓塞（TACE）治疗对肝癌组织HIF3α表达的影响及其与患者临床病理特征及新生微血管密度（MVD）的相关性。方法 采用免疫组织化学染色（IHC）检测128例原发性肝细胞癌患者实施TACE（72例）后二期手术切除的肝癌组织及未实施TACE（56例）手术切除的肝癌组织的HIF3α及CD34蛋白表达，根据HIF3α阳性染色计分，CD34阳性染色计数MVD，登记相关肝细胞癌患者的临床病理参数。采用t检验比较实施与未实施TACE患者肝癌组织HIF3α蛋白表达差异；采用Pearson相关检验分析实施TACE治疗患者肝癌组织中HIF3α蛋白表达水平与临床病理特征及MVD的相关性。结果 与未实施TACE患者的癌旁组织相比，实施TACE患者癌旁组织HIF3α蛋白表达显著增强（t=-22.789，P＜0.01），未实施TACE者癌旁组织中心区呈低表达（低表达者占95.83%）；实施TACE者肝癌组织栓塞周围组织HIF3α蛋白表达与肿瘤直径（r=0.250，P＜0.05）、原发灶浸润深度（r=0.275，P＜0.05）、TNM分期（r=0.430，P＜0.01）及MVD（r=0.799，P＜0.01）均呈正相关，与其他临床病理参数无明显相关。结论 TACE治疗可增强肝脏栓塞周围组织HIF3α蛋白表达，HIF3α表达与TACE治疗后肝脏栓塞区周围血管重建及肿瘤进展有密切关联，HIF3α可作为肝癌TACE治疗后血管重建及肿瘤进展的一种标志分子。

HIF3α 肝细胞癌 肝动脉插管化疗栓塞 临床病理特征

【 Abstract】 Objective To investigate the correlation of HIF3α expression with histopathological features and microvessel density(MVD)in patients with hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization(TACE). Methods One hundred and twenty eight patients with primary hepatocellular carcinoma were enrolled,including 72 cases undergoing TACE (TACE group)and 56 cases without TACE(non-TACE group).The expressions of HIF3α and CD34(marker for MVD)proteins in hepatocellular carcinoma tissues were detected by immunohistochemistry(IHC),HIF3α positive staining score and MVD were calculated.The difference between groups was analyzed by t-test;the correlation of HIF3α protein expression with histopathological parameters and MVD was analyzed by Pearson correlation test. Results Compared to non-TACE liver tissue, HIF3α protein expressed in TACE hepatocellular carcinoma tissue was significantly increased (t=-22.789,P＜0.01),while the central area of most non-TACE carcinoma(95.83%)showed low HIF3α expression.HIF3α protein expression was positively correlated with tumor size(r=0.250,P＜0.05),primary tumor invasion depth(r=0.275,P＜0.05),TNMstaging(r=0.430,P＜0.01)and MVD(r=0.799,P＜0.01)in the area ofsurrounding TACE embolism.Conclusion The expression ofHIF3α protein in hepatocellular carcinoma is increased after TACE treatment,and is correlated with angiogenesis and treatment response.

【 Key words】 HIF3α Hepatocellular carcinoma Transcatheter arterial chemoembolization Clinicopathological features

原发性肝细胞癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是世界常见的恶性肿瘤之一，我国目前发病人数约为34.7万人，约占全球总发病人数的55%，死亡约32.3万人，约占全球总死亡人数的45%[1]。因多数患者在诊断确立时不能耐受手术切除，以肝动脉插管化疗栓塞（TACE）为代表的姑息性治疗手段成为治疗PHC的重要手段之一，但实施TACE治疗患者5年生存率仍低于10%[2]。TACE造成的肿瘤局部低氧环境可能促进了新生血管的生成进而增加了肝癌复发、转移的机会[3]。

目前已证实在缺氧微环境下，缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）的表达对肿瘤顺利完成局部微血管生成、保障肿瘤快速增殖的营养需求至关重要[4]。近年来对于HIF3α在缺氧微环境下扮演的角色成为新的研究热点，其功能及临床意义尚不十分明确[5]。本研究将分析实施TACE治疗肝癌组织HIF3α蛋白表达水平与肝癌患者临床病理特征、栓塞周围组织微血管密度（microvessel density，MVD）的相关性，验证TACE治疗对肝癌栓塞周围组织HIF3α蛋白表达的影响，分析HIF3α与TACE治疗后血管生成及患者临床病理特征的关联，探讨HIF3α作为TACE治疗肝癌治疗分子标靶的可能性。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取我院2005至2015年收治的128例PHC患者，均经临床检查、甲胎蛋白（AFP）测定、B超及CT检查或经皮肝穿刺活检诊断为PHC。登记上述患者性别、年龄、肿瘤部位、直径、瘤体数量、浸润深度、组织学分型、分化程度等临床病理参数。TNM分期参照2010年美国癌症联合委员会（AJCC）肝癌TNM分期系统登记。

1.2 方法

1.2.1 临床治疗 72例实施TACE患者参照卫生部《原发性肝癌诊疗规范（2011年版）》操作，采用Seldinger技术选择肝动脉及其分支行化疗栓塞术，注入含有氟尿嘧啶1 000mg、顺铂40mg、丝裂霉素20mg和超液态碘油8～20ml的混合剂。1个疗程栓塞3～5次，每次间隔时间为30d左右，在疗程中获手术机会者行二期外科手术切除。56例未实施TACE者按卫生部诊疗规范行择期手术切除。所有患者病理组织常规取材、蜡块包埋及切片。

1.2.2 免疫组化染色检测肝细胞癌组织目的蛋白原位表达 取上述蜡块组织，切片、贴片，65℃烘片过夜，二甲苯脱蜡、酒精洗脱、水洗，3%H2O2溶液中避光浸泡15min，置入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）的高压锅内抗原修复3min，自来水冲洗冷却，PBS清洗，湿盒内分别滴加一抗HIF3α（abcam，ab10134，稀释度1∶100）、CD34（福州迈新，MAB-0034，稀释度1∶100）置4℃冰箱孵育过夜；次日PBS充分洗涤，分别滴加多克隆HRP羊抗兔IgG二抗（MaxVision，福州迈新，150601407）室温孵育15min，PBS清洗，滴加DAB显色液镜下控制显色，清洗、终止反应；苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，溶性树脂封片，显微镜观察、拍照，根据染色结果分析评分，由2位高年资病理医师分别进行双盲阅片。HIF3α阳性表达为细胞胞浆呈现棕黄色颗粒。在组织背景清晰的前提下，根据阳性细胞染色强度及其所占实质细胞百分比进行半定量结果判断评分（参照文献[6]）：先根据阳性细胞染色强度评分：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分；再根据阳性细胞数占实质细胞百分比评分：每张切片观察5个视野（×100），阳性细胞数百分比评分：阴性为0分；＜10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4分；两项评分结果相乘即为阳性等级：阴性（-）为0分；弱阳性（+）为1～4分；阳性（++）为6～8分；强阳性（+++）为9～12分。计数资料分组统计：≤4分（-～+）归为低表达组，≥6分（++～+++）归为高表达组。MVD结果判定及分析：CD34标记血管内皮细胞染成棕黄色为阳性，由两位高年资病理医师分别在低倍镜下选取肿瘤浸润区域微血管数量最密集的视野，再在200倍视野范围计算18个视野的微血管数目，取其平均值作为MVD（个/HP）。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件，计量资料以表示，比较采用t检验，变量间相关性分析采用Pearson相关检验。

2 结果

2.1 实施及未实施TACE肝细胞癌组织HIF3α蛋白原位表达比较 采用IHC法检测肝癌组织中HIF3α蛋白原位表达，结果显示：与未实施TACE肝癌癌旁组织相比，实施TACE肝癌栓塞周围组织HIF3α蛋白表达（高表达者占87.50%）显著增强（t=-22.789，P＜0.01），主要表达为肝细胞胞浆内呈现分布面积较广、颜色较深的棕褐色颗粒。未实施TACE者肝癌组织中心区域HIF3α蛋白较癌旁组织增高（t=-4.193，P＜0.01），但亦以低表达为主（低表达者占95.83%）；实施TACE者癌中心组织为栓塞坏死区，HIF3α蛋白无阳性染色（图1，表1）。

2.2 实施与未实施TACE治疗肝癌组织HIF3α蛋白表达与MVD的相关性 采用IHC法检测TACE肝癌组织CD34蛋白表达计数MVD，结果显示：与未实施TACE治疗肝癌癌旁组织相比，肝癌肿瘤中心组织中的MVD明显增高（t=18.807，P＜0.01），实施TACE治疗栓塞坏死周围组织MVD显著增高（t=-29.965，P＜0.01）；与未实施TACE治疗肝癌肿瘤中心组织相比，栓塞坏死周围组织MVD无统计学差异（t=-0.541，P＞0.05，图2，表2）。

采用Pearson相关检验分析实施TACE治疗肝癌栓塞坏死周围组织HIF3α蛋白表达水平与MVD的相关性，显示HIF3α蛋白表达水平与MVD呈显著正相关（r=0.799，P＜0.01）。

2.3 肝细胞癌组织HIF3α蛋白原位表达与临床病理特征的相关性 Pearson相关检验72例患者实施TACE治疗肝癌组织HIF3α蛋白表达与临床病理特征的相关性，结果发现：实施TACE者肝癌组织栓塞周围组织HIF3α蛋白表达与肿瘤直径（r=0.250，P＜0.05）、原发灶浸润深度（r=0.275，P＜0.05）、TNM分期（r=0.430，P＜0.01）及MVD（r=0.799，P＜0.01）均呈正相关，与其他临床病理参数无明显关联（P＞0.05，表3）。

图1 实施与未实施TACE治疗原发性肝癌HIF-2α表达比较（A：未实施TACE肝癌中心组织；B：未实施TACE癌旁组织；C：TACE栓塞周围组织，×100）

表1 实施与未实施TACE肝癌中心及癌旁组织HIF3α蛋白表达比较

图2 实施与未实施TACE治疗原发性肝癌MVD检测比较（A：未实施TACE肝癌中心组织；B：未实施TACE癌旁组织；C：TACE栓塞周围组织，×100）

表2 实施与未实施TACE的肝癌中心及癌旁组织MVD比较

3 讨论

目前发现的HIF成员有HIF1α、HIF2α、HIF3α三种，其中HIF3α是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体，1998年由Gu等[7]首先发现。目前国内外对HIF3α研究较少。HIF3α广泛存在于人和动物体内,主要在心脏、胎盘组织、骨骼肌以及肺组织中表达,而在肝脏和肾脏组织中表达量较低[8]。有研究报道HIF3α在肝癌组织中表达相对较高[9]，但HIF3α在肝动脉插管化疗栓塞肝癌中的表达水平与临床病理学特征及MVD的相关性研究尚未见报道。

本研究发现，与未实施TACE肝癌癌旁组织相比，实施TACE肝癌栓塞周围组织HIF3α蛋白表达显著增强，而HIF3α蛋白在未实施TACE肝癌组织中心区及癌旁正常组织均呈低表达，癌旁表达相对更低（图1，表1），表明TACE治疗后造成的局部缺氧微环境有利于增强HIF3α蛋白表达。

本研究通过临床病理学分析，发现实施TACE者肝癌组织栓塞周围组织HIF3α蛋白表达与肝癌肿瘤直径、原发灶浸润深度、TNM分期及MVD均呈正相关，而与其他临床病理参数无明显关联，提示TACE治疗后造成的局部缺氧微环境通过增加HIF3α蛋白表达进一步促进栓塞周围残存的肝癌细胞生长及栓塞周围肝组织的血管重建，但对于未进行TACE治疗的原发灶并无此促进作用。

综上所述，我们的研究表明TACE治疗可增强肝脏栓塞周围组织HIF3α蛋白表达，HIF3α可能与TACE治疗后肝脏栓塞区周围血管重建及肝癌患者肿瘤直径、原发灶浸润深度、TNM分期有关，HIF3α可作为一种有价值的评估肝癌TACE治疗后血管重建及肿瘤进展的标志分子。

表3 原发性肝癌TACE治疗HIF3α蛋白表达与临床病理特征的相关性分析（例）

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Correlation of HIF3α expression with histopathological features and microvessel density in patients with hepatocellular carcinoma after transcatheter arterial chemoembolization

ZHANG Xiaolan,GONG Hui.Department of Pathology,Huzhou First People's Hospital, Huzhou 313000,China

2016-01-07）

（本文编辑：田云鹏）

313000 湖州市第一人民医院病理科