SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突变质粒的构建及表达

张清秀，魏秀娥，高红，荣良群

(徐州医科大学第二附属医院 神经内科，江苏 徐州 221006)



·论 著·

SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突变质粒的构建及表达

张清秀，魏秀娥，高红，荣良群

(徐州医科大学第二附属医院 神经内科，江苏 徐州 221006)

目的:缺失突变SynGAP(1- 700aa)- Flag中的670- 685aa片段，为后续实验中新的药物靶点的鉴定提供可靠理论依据。方法:以前期构建好的pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag 质粒为模板，重叠延伸PCR技术缺失突变670- 685aa片段，扩增出目的片段；限制性内切酶将载体线性化，然后分别纯化目的片段与线性化载体；利用同源重组技术连接目的片段与线性化载体，获取重组质粒；PCR技术鉴定重组质粒构建成功，测序进一步验证质粒碱基正确；将质粒转入293T细胞，免疫印迹鉴定能否成功表达。结果:重叠PCR成功缺失突变670- 685aa片段，成功构建重组质粒，且测序正确。免疫印迹结果表明，SynGAP(1- 700aa)缺失突变670- 685aa片段后仍可成功表达。结论:成功缺失突变SynGAP(1- 700aa)中的670- 685aa片段，并且在细胞株中稳定表达。该质粒的成功构建，为我们的后续研究奠定实验基础。

SynGAP； 重叠延伸聚合酶链式反应； 缺失突变

突触GTP酶活化蛋白(SynGAP)是神经元Ras GTP酶活化蛋白(RasGAP)，在大脑内选择性表达，在兴奋性突触中高度表达，受CaMKⅡ磷酸化调控，自身负调控Ras的活性及其下游的信号通路。SynGAP不仅在神经元发育及突触可塑性中具有重要作用，在缺血性脑损伤中也发挥调控作用。Rong 等[1]发现脑缺血后SynGAP表达受抑制。Song等[2]发现脑缺血后SynGAP丝氨酸磷酸化水平显著增加，导致MAPK信号通路的激活，保护脑缺血神经元损伤。SynGAP可通过与PSD- 95、NMDAR受体形成复合物，调节ERK/MAPK信号通路、突触可塑性以及学习记忆[3]。我们前期实验已经证实PSD- 93可以与SynGAP结合，且结合位点位于SynGAP的670- 685aa片段，因此我们拟构建SynGAP的突变体，期望为后续研究及临床应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

质粒抽提试剂盒(Promega，A1460)；In- FusionTMPCR Cloning Kit(美国clontech，639626)；限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ(New England Biolabs，R0136V)；Taqpolymerase(SinoBio，E001- 02B)；dNTPs(Takara，D4030A)；5kb DNA ladder Marker[富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司，SM0311]；琼脂糖(上海赛百盛基因技术有限公司，GA4- 100)；Primer(上海捷瑞生物工程有限公司)；DMEM培养基(Gibco，10- 013- CV)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技术有限公司)；10×PEI(Sigma- Aldrich，40，872- 7)；FLAG antibody(Sigma- Aldrich，#F1804)[4]；Goat- anti- mouse IgG(H+L)- HRP(南京巴傲得生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器

PCR仪(美国应用生物系统公司，ABI2720)，positive clone测序仪(美季生物技术公司，ABI3730)，凝胶成像仪(广州誉维生物科技仪器有限公司，Tanon 1600R)，细菌摇床(太仓华利达实验设备有限公司，HI- 9211K)，细菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，LRH- 500F)，高速离心机[日立(中国)有限公司，TGL- 16G- A]，电泳仪(美国Bio- Rad)，电转仪(美国Bio- Rad)。

1.3 工具载体

GV143(4.8kb)，pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag质粒，293T细胞。

1.4 载体酶切

在总体积为10μl酶切体系中，工具载体GV143(4.8kb) 1μl，XhoⅠ和KpnⅠ各0.5μl，10×buffer 1μl， 100×BSA 0.5μl，不足ddH2O补足，37℃双酶切2h获得线性化载体。然后胶回收试剂盒纯化线性化载体。

1.5 重叠PCR获取缺失突变质粒

以构建好的SynGAP(1- 700aa)质粒为模板，引物P1:5′- TACCGGACTCAGATCTCGAGATGAGCAGGTCTCGAGCCTCCATC- 3′，P2:5′- GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCAGCACCTCCCAGAGTAGGGCATGCAGTGTGGAGAG- 3′，P3:5′- GTAGGGCATGCAGTGTGGAGAGCTCTCGGCCATTGGAGATCTCATACAAAAACTGC- 3′，其中P1、P2分别为目的基因片段的上下游引物，P3为中间缺失基因序列的上下游碱基构成，按照Promega试剂盒说明书，通过重叠PCR缺失突变670- 685aa序列。首先以P1和P3引物缺失670- 685aa序列，获得2058bp片段a，然后以P1和P3为引物，序列a为模板，获取2094bp 片段b，那么序列b则为最终的目的片段，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定其扩增大小与目的基因片段大小相近。胶回收试剂盒纯化目的片段，然后与载体相连，PCR验证，测序。

1.6 重组质粒构建

将纯化好的线性化载体GV143以及目的基因片段以一定比例加入到10μl反应体系中，10×buffer 1μl，DNA连接酶1μl，DNA∶pCMV- C- Flag=9∶1，16℃，4h，琼脂糖凝胶初步鉴定重组质粒大小[5]。

1.7 PCR鉴定重组质粒构建成功

以构建好的重组质粒为模板，根据目的片段序列设计上下游引物P1:5′- GTGCCCTGTTGAAGGACC- 3′，P2:5′- CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG- 3′，通过PCR鉴定目的片段与载体是否成功连接。然后抽提质粒，测序。

1.8 免疫印迹检测重组质粒表达情况

PEI转染法将纯化好的重组质粒转入293T细胞。根据前期实验条件，分别用无血清培养基稀释质粒与10×PEI。2 μg质粒与2μl PEI混匀后，静置15 min，期间将细胞全培养液换为无血清培养液，然后将质粒加入细胞培养液中，2～3h换为正常培养基，培养48 h，收集细胞，超声破碎细胞，BCA法测蛋白，SDS- PAGE凝胶电泳检测融合蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 目的基因片段的获取

前期实验已经构建SynGAP(1- 700aa)片段质粒，免疫印迹证明其可在细胞内过表达。实验需要将SynGAP(1- 700aa)质粒的(670- 685aa)氨基酸缺失掉，因此，我们采用缺失突变重叠PCR技术获得最终目的基因。结果见图1。

1.缺失掉670- 685aa片段的SynGAP(1- 700aa)线性化DNA片段； 2.5kb DNA Marker

图1 重叠延伸PCR技术获取目的基因
Fig 1 Obtain targeted gene by overlap extension PCR technology

2.2 载体酶切

工具载体GV143(4.8kb)经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，37℃酶切2h获得线性化载体。酶切结果见图2。

2.3 PCR验证重组质粒构建成功

将PCR获得的目的基因以及酶切获得的线性化载体回收纯化(胶回收试剂盒)，PCR产物交换入线性化表达载体，然后PCR鉴定重组质粒构建成功。鉴定结果见图3。

2.4 重组质粒表达检测

将构建好的质粒PEI法转入293T细胞，转染24 h，观察转染率，并收集细胞，检测目的蛋白的表达情况。结果显示，重组质粒转染率大于80%(图4A)，与对照组(未转染质粒的人胚肾293T细胞)相比，目的蛋白在细胞内表达量显著增加，表明目的基因构建成功(图4B)。

1.10kb Marker； 2.载体酶切产物；3.未酶切载体

图2 载体及载体线性化酶切结果
Fig 2 GV143 vector and its linearized vector digested by endonuclease

1.阴性对照(ddH2O)；2.阴性对照(空载自连对照组)；3.阳性对照(GAPDH)；4.Marker，自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5～7.SynGAP1 1～3号转化子

图3 PCR鉴定重组质粒构建成功
Fig 3 Identify the recombinant plasmid was successfully constructed using PCR

3 讨 论

神经元特异性RasGTP酶活化蛋白SynGAP，在哺乳动物前脑的突触后致密部高度表达。SynGAP是一个复杂的基因，具有多个结构域。其可通过剪切形成不同的异构体，SynGAP mRNA的可变剪切形成C- 末端的多种异构体，包括α、β、γ。SynGAP的N- 末端具有ras- GAP结构域，而其C2结构域则主要与Ca2+以及脂筏结合。研究发现，SynGAP C- 末端的QTRV是与PSD- 95/SAP90的第3个PDZ结构域结合必需的，并使其串集于NMDAR形成多蛋白复合物，参与脑损伤[6]。

图4 免疫印迹检测质粒表达情况 ×200

Fig 4 Western blotting isused to detect the plasmid expression ×200

SynGAP作为信号通路中的关键蛋白之一，其上游受NMDAR及CAMKⅡ、CDK5调控，下游负调控小G蛋白，如ras、rap等，同时也负调控AMPA受体向兴奋性突触后膜运输[7]，参与调控各种病理生理机制，在脑缺血、智力低下、儿童自闭症、突触可塑性中都发挥重要作用。SynGAP1基因突变可导致一些疾病，典型的就是儿童智力低下和儿童自闭症。研究发现，SynGAP1从头截短突变导致非综合征性智力障碍(NSID)[8]。SynGAP1- /+杂合子具有与精神分裂症类似的行为表征。Guo等[9]发现，SynGAP1的表达减少将会导致异常的行为。前期研究显示，SynGAP在神经系统发育以及突触可塑性中具有重要作用。SynGAP1与NMDAR受体及PSD95结合，调节骨架蛋白Actin及AMPAR受体上膜，进而影响突触可塑性以及长时程增强效应(LTP)[10]。synGAP与 PSD- 95相互作用决定树突棘的生成及成熟树突棘大小[11- 12]。此外，SynGAP- /- 导致小鼠出生后1周内死亡[13]。Knuesel等[14]发现SYNGAP1蛋白减少会促进凋亡，这与我们的前期研究结果一致。脑缺血后synGAP与 PSD- 93结合，激活下游的Ras信号通路，介导细胞凋亡。

SynGAP突变会导致一系列神经疾病，作为信号网络中的关键成员之一，研究其结构及功能具有重要作用。因此，我们在前期研究基础上，成功构建了SynGAP突变体，为后续研究提供新的靶向。

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Construction and expression of SynGAP(1- 700aa)plasmid mutanted deletion at 670- 685aa residues

ZHANG Qing- xiu，WEI Xiu- e，GAO Hong，RONG Liang- qun

(DepartmentofNeurology，SecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221006，China)

Objective： To mutant deletion 670- 685aa fragments of SynGAP(1- 700aa)- Flag plasmid，to provide a reliable theoretical basis for subsequent experiments on identification of new drug targets. Methods： The constructed pCMV- SynGAP(1- 700aa)- Flag plasmid as template，mutanted deletion 670- 685aa and amplified fragment by overlap extension PCR(SOE PCR) ; then made vector linearized with restriction endonuclease，and purified amplified fragment and the linearized vector; connected the linearized vector and amplified fragment by homologous recombination technology to obtain recombinant plasmid; PCR technology was used to identify if recombinant plasmid was successfully constructed，sequence technology was used to further verify bases in constructed plasmid; and finally transfected the mutanted plasmid into 293T cells，collected cells after 48 hours，Western blot was used to identify whether it could express sucessfully. Results： 670- 685aa was mutanted deletion successfully by SOE PCR，and recombinant plasmid was successfully constructed，and the sequence results was correct.Western blot analysis showed that SynGAP(1- 700aa) plasmid mutanted deletion 670- 685aa could express successfully. Conclusion:SynGAP(1- 700aa) plasmid mutantes deletion 670- 685aa successfully，and it can be expressed stably in cell lines.The successfully constructed plasmid will be an experimental basis for our follow- up study．

SynGAP; gene splicing by overlap extension PCR; deletion mutation

2016- 06- 28

2016- 07- 17

国家自然科学基金青年项目(81301120)；江苏省高校自然科学基金面上项目(13KJB320027)

张清秀(1980-)，女，江苏徐州人，副主任医师，医学博士。E- mail：zhangqingxiu@163.com

荣良群 E- mail：rongliangqun@163.com

张清秀，魏秀娥，高红，等.SynGAP(1- 700aa)中670- 685aa缺失突变质粒的构建及表达[J].东南大学学报:医学版，2016，35(6)：832- 835.

Q782

A

1671- 6264(2016)06- 0832- 04

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．002