激酶抑制剂DRB在骨髓瘤细胞中调控锌指转录因子IKZF1的机制研究

刘青，蒋小岗

(苏州大学药学院，江苏 苏州 215123)



·论 著·

激酶抑制剂DRB在骨髓瘤细胞中调控锌指转录因子IKZF1的机制研究

刘青，蒋小岗

(苏州大学药学院，江苏 苏州 215123)

目的:研究激酶抑制剂调控多发性骨髓瘤细胞死亡关键蛋白锌指转录因子IKZF1的分子机制。方法：在两种多发性骨髓瘤细胞OPM2和U266中用酪蛋白激酶抑制剂DRB处理不同时间后，蛋白质免疫印迹实验检测IKZF1的表达变化，研究细胞凋亡相关蛋白在药物处理后的表达和激活情况；用漆黄素(fisetin)和凋亡酶抑制剂处理U266细胞后检测IKZF1、procaspase- 3及其剪切体的变化。结果：激酶抑制剂DRB在OPM2细胞中但不在U266细胞中降低IKZF1、procaspase- 9、procaspase- 3、BID等蛋白的表达；漆黄素在U266细胞中激活细胞凋亡并导致IKZF1的剪切；凋亡酶抑制剂处理两细胞株后发现IKZF1剪切被抑制。结论：在多发性骨髓瘤细胞OPM2和U266中激活凋亡酶可以导致IKZF1的剪切和降解。

多发性骨髓瘤； IKZF1； 凋亡酶； DRB； 漆黄素

多发性骨髓瘤是第二大血液肿瘤，到目前为止只能用药物进行治疗却不能完全治愈[1]。临床治疗多发性骨髓瘤的一线药物主要有类固醇、蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂沙利度胺及其结构衍生物来那度胺[2- 3]。然而病人经过这些药物治疗后易产生耐药性和复发，对这类疾病的治疗提出了很大的挑战。如免疫调节剂来那度胺的长期使用会造成骨肉瘤细胞U266产生耐药性[4]，蛋白酶体抑制剂硼替佐米的长期使用会造成骨肉瘤细胞OPM2产生耐药性[5]。近期的研究发现沙利度胺和来那度胺可以促进一个E3泛素连接酶复合物的底物受体cereblon与两个锌指转录因子IKZF1和IKZF3的结合，从而促进它们的泛素化，并经过泛素- 蛋白酶体途径使它们降解[6- 7]。这两个转录因子的降解最终导致骨髓瘤细胞的死亡[6]。这些研究表明IKZF1和IKZF3是调控骨髓瘤细胞存活的关键蛋白。如果我们能发现调控这两个蛋白降解的新机制，就有可能为对耐药骨髓瘤病人的治疗提供新的思路。

自从2001年美国食品药物管理局批准格列卫治疗费城染色体阳性慢性髓性白血病[8]以来，已经有28个小分子蛋白激酶抑制剂被用于治疗多种肿瘤[9- 11]，使得激酶成为一类最大的肿瘤分子靶向治疗的靶标分子[12]。在我们的前期实验中尝试了几个激酶抑制剂对骨髓瘤细胞中IKZF1表达的影响，发现在一些骨髓瘤细胞如OPM2中IKZF1的蛋白水平可以被一个酪蛋白激酶Ⅱ抑制剂DRB(5，6- dichlorobenzimidazole riboside)调控，然而DRB在另一些细胞系中对IKZF1的表达并没有影响[13]。DRB在不同骨髓瘤细胞中如何调控IKZF1蛋白的表达这一分子机制还不清楚。本研究中我们将利用生物化学、抑制和激活凋亡酶等手段来探索在两个骨髓瘤细胞OPM2和U266中DRB调控IKZF1降解的分子机制。通过对细胞凋亡过程中的关键蛋白如caspase、促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的检测发现其可能的调控机制，并利用药物激活细胞凋亡后探索对IKZF1的调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

多发性骨髓瘤细胞系U266购自美国ATCC；OPM2细胞系购自德国DSMZ。

1.2 实验材料

DMEM高糖培养基(SH40007.01，GE healthcare life sciences)；RPMI 1640培养基(SH30809.01B，HyClone)；胎牛血清(FBS，04- 001- 1ACS，Biological Industries)；青霉素- 链霉素(GNM 15140，吉诺生物医药技术有限公司)；胰酶(Trypsin，1- 435- 792- 800，GE healthcare life sciences)；蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail tablets，Roche)；预染蛋白Marker(26616，Thermo Fisher)；二甲基亚砜(DMSO，A36720100，AppliChem)；Procaspase- 3抗体(9662，CST)；PARP1抗体(9532，Cell Signaling Technology)；GAPDH抗体(R1210- 1，杭州华安生物技术有限公司)；Mcl- 1(YT5160)，Bid(YT0488)，Bax(YT0456)，IKZF1，Procaspase- 6(YC0105)，Procaspase- 7(YT0659)均购自ImmunoWay；Procaspase- 9(RLM3077)购自睿瀛生物技术有限公司；ECL发光液购自Millipore；酪蛋白激酶II抑制剂DRB(5，6- dichlorobenzimidazole riboside)购自Sigma；Fisetin购自上海同田生物技术有限公司；广谱凋亡酶抑制剂z- VAD- fmk和caspase- 3特异性抑制剂z- DQMD- fmk均购自APExBio；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器

超纯水机(MicroPure UV，Thermo)；微量紫外分光光度计2000(Thermo)；金属浴(GL- 150，其林贝尔)；电泳仪及电泳槽、转膜槽(天能)；凝胶成像系统(ChemiDoc MP，Bio- Rad)；高速低温离心机(SL 16R，Thermo)；立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX- 50KBS，上海申安医疗器械厂)；细胞培养箱(BB15，Thermo)；生物安全柜(BSC- 1000，苏净安泰)；倒置生物显微镜(XD- 202，南京江南永新光学有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 多发性骨髓瘤U266和OPM2细胞用含10%FBS、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1链霉素的改良型RPMI 1640培养基培养。细胞置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内，待细胞生长至90%左右时传代，收集细胞到离心管中，低速离心沉淀细胞，弃去上清液，用新鲜培养基重悬细胞并继续在培养箱内培养。

1.4.2 药物处理 在倒置生物显微镜下用细胞计数板进行细胞计数，按照5×105个·ml-1的密度将细胞种在25 cm2的培养瓶中，培养12 h后加入50 μmol·L-1DRB(50 mmol·L-1母液)处理细胞，同时对照组中加入相同体积的DMSO，分别在处理0、2、4、6 h后收集细胞。抑制剂预处理实验中，预先加入广谱caspase抑制剂z- VAD- fmk(50 μmol·L-1)或caspase- 3特异性抑制剂z- DQMD- fmk(50 μmol·L-1)处理细胞4 h，再加入50 μmol·L-1DRB处理6 h或者50 μmol·L-1Fisetin处理9 h后收集细胞。

1.4.3 蛋白质免疫印迹(Western blotting)实验 细胞用药物处理后，将悬浮细胞收集到离心管中，4 ℃ 600×g离心3 min，加入含有新鲜蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上静置30 min，15 000×g离心10 min，收集上清至新的离心管中，即为总蛋白裂解液。将各组的蛋白样品用BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后统一调整为相同浓度，加入5倍上样缓冲液在金属浴中煮7 min。离心后在SDS- PAGE中加入20 μg蛋白样品进行电泳分离，上层胶70 V用时30 min，下层胶110 V用时100 min。电泳结束后将胶上的蛋白转移到用甲醇活化的PVDF膜上，260 mA转膜120 min。转膜结束后清洗去除甲醇后在5%的脱脂奶粉中封闭1 h。用相应的一抗室温孵育2 h或者4 ℃孵育过夜，用TBST洗3次，每次10 min，用相应的二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，最后用ECL发光液显影[14- 15]。

1.5 统计学处理

每个实验独立重复3次，数据采用Excel进行统计分析。Western blotting条带用Image J进行灰度定量。两组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 激酶抑制剂DRB在OPM2细胞中但不在U266细胞中诱导IKZF1的降解

DRB处理OPM2细胞4 h和6 h后IKZF1的表达有明显的下降；但是在U266细胞中，IKZF1蛋白水平基本没有变化(图1A、B)。统计结果得出了相同的结论(图1C、D)。

A.DRB在OPM2细胞中对内源性IKZF1蛋白表达水平的影响； B.DRB在U266细胞中对内源性IKZF1蛋白表达水平的影响； C、D.对A和B中3次重复实验结果定量分析

采用成对的student’st检验对DRB处理的样品与DMSO处理的样品的比值进行统计分析，a与0 h比较，P<0.05

图1 酪蛋白激酶抑制剂DRB在骨髓瘤OPM2细胞中但不在U266细胞中下调锌指转录因子IKZF1

Fig 1 Casein kinase Ⅱ inhibitor DRB downregulated a zinc finger transcription factor IKZF1 in OPM2 but not in U266 cells

2.2 DRB在OPM2细胞中但不在U266细胞中诱导procaspase- 9和procaspase- 3的特异性剪切

在这两个细胞中procaspase- 6/7和剪切后的caspase- 6的表达受DRB的调控是一致的。procaspase- 7在两个细胞株中的表达基本不受DRB的影响，但procaspase- 6的表达在DRB处理后有所下降，DRB处理后剪切的caspase- 6表达有所升高。但是Procaspase- 9/3和剪切的caspase- 3在两个细胞中的表达受DRB的调控并不完全相同。在OPM2细胞中，Procaspase- 9/3在DRB处理4 h后都发生了下调，但是在U266细胞中不受DRB的影响(图2)。相应地，剪切后活化的caspase- 3在OPM2细胞中经DRB处理4 h后表达上升，但在U266细胞中尽管实验条件相同却没有检测到剪切后的caspase- 3蛋白条带(图2A、B)。

A、B.OPM2细胞和U266细胞用DRB(50 μmol·L-1)处理后蛋白质印迹检测procaspase和剪切的caspase蛋白水平； C、D.DRB处理后的OPM2细胞中procaspase- 3和procaspase- 9的定量分析； E、F.DRB处理后的U266细胞中procaspase- 3和procaspase- 9的定量分析

采用成对的student’st检验对DRB处理的样品与DMSO处理的样品的比值进行统计分析，与0 h比较，aP<0.05，bP<0.01

图2 DRB在OPM2细胞中但不在U266细胞中激活caspase- 9和caspase- 3

Fig 2 DRB activated caspase- 9 and caspase- 3 in OPM2 but not in U266 cells

2.3 DRB特异性地在OPM2细胞中但不在U266细胞中降低促凋亡蛋白BID的表达

在OPM2细胞中，促凋亡蛋白BID在DRB处理4 h后发生下降，这极有可能是发生了剪切降解。但是该蛋白在U266细胞中并不受DRB影响。Bax和Bak在DRB处理后的两个细胞中的表达均没有发生变化，但Mcl- 1表达均发生了下降，它们在两种细胞中的表达受DRB的调控基本一致(图3)。定量分析结果发现BID/Bax的比例在U266中没有发生明显的变化，但在OPM2细胞中有显著的降低。这些实验结果表明，在DRB处理后OPM2细胞发生了凋亡而U266细胞却没有发生凋亡。

A、B.OPM2细胞和U266细胞用DRB(50 μmol·L-1)处理后蛋白质印迹检测BID、Bax、Bak、Mcl- 1的蛋白水平； C、D.DRB处理后OPM2细胞中Bid和Bid/Bax的定量分析； E、F.DRB处理后U266细胞中Bid和Bid/Bax的定量分析

采用成对的student’st检验对DRB处理的样品与DMSO处理的样品的比值进行统计分析，与0 h比较，aP<0.05

图3 DRB在OPM2和U266细胞中差异调控促凋亡蛋白BID的表达

Fig 3 DRB differentially regulated the cell proapoptotic protein， BID in OPM2 and U266 cells

2.4 Fisetin可在U266细胞中激活细胞凋亡并剪切降解IKZF1

当用凋亡抑制剂z- VAD- fmk和z- DQMD- fmk预处理细胞后，我们发现DRB在OPM2细胞中对IKZF1的降解完全被抑制，蛋白水平恢复到没有被DRB处理的水平(图4A)。这一结果说明DRB激活了caspase- 3，活化的caspase- 3剪切了IKZF1，并导致该蛋白表达水平发生了大幅度的降低。漆黄素可以在U266细胞中剪切procaspase- 3产生活化的caspase- 3(图4B)。我们也发现这一化合物可以导致IKZF1的降解。但当用两种凋亡酶抑制剂抑制细胞凋亡后，在U266细胞中IKZF1的表达水平恢复到了没有被漆黄素处理的水平。这一现象说明在OPM2和U266细胞中激活caspase- 3导致IKZF1的降解。

A.在OPM2细胞中caspase- 3特异性抑制剂和广谱凋亡酶抑制剂阻止了DRB诱导的IKZF1表达的降低； B.在U266细胞中caspase- 3特异性抑制剂和广谱凋亡酶抑制剂阻止了fisetin诱导的IKZF1表达的降低

图4 在多发性骨髓瘤细胞OPM2和U266中激活caspase- 3导致IKZF1蛋白的降低

3 讨 论

通过对细胞凋亡酶、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的蛋白质免疫印迹检测发现，酪蛋白激酶Ⅱ抑制剂DRB在不同的多发性骨髓瘤细胞中对IKZF1蛋白有不同的调控关系。通过对其分子机制的详细研究，我们发现，DRB可以促进procaspase- 9的降解，激活caspase- 9并剪切procaspase- 3，从而使得caspase- 3对IKZF1剪切并使其降解。利用广谱caspase抑制剂和caspase- 3特异性抑制剂，我们发现在OPM2细胞中IKZF1的降解均被抑制，这些事实说明IKZF1是被caspase- 3直接或其下游蛋白间接剪切而降解的。尽管IKZF1的氨基酸序列中含有数个caspase- 3凋亡酶的保守系列(DXXD)[16- 17]，我们不能完全排除caspase- 3的下游蛋白对IKZF1的降解。事实上，我们通过蛋白质组学的研究发现，在DRB诱导OPM2细胞的凋亡过程中，根据酶切位点分析显示确实有一些蛋白并不是直接被蛋白凋亡酶所酶切的，预示着其它蛋白酶也可能在这一过程中被激活[18]，从而剪切它们的底物蛋白。

而在U266细胞中，DRB不能导致procaspase- 9的剪切和激活，不能进一步剪切procaspase- 3从而无法激活下游细胞凋亡信号通路，不能剪切并降解IKZF1蛋白。但是当我们用漆黄素在U266细胞中激活caspase- 3后，IKZF1蛋白水平发生了明显的降低，这一降低可以被凋亡酶抑制剂所抑制，证实caspase- 3的剪切导致了IKZF1蛋白水平的降低。这一结果证实在多发性骨髓瘤细胞中激活细胞凋亡可以导致IKZF1蛋白表达水平的降低，从而可能为耐沙利度胺及其衍生物的骨髓瘤病人提供可能的治疗方法。

尽管我们的实验解释了DRB在两个骨髓瘤细胞中调控IKZF1蛋白的分子机制，但是我们的实验还没有完全解释清楚许多问题。虽然酪蛋白激酶Ⅱ在OPM2和U266细胞中的表达水平相仿[19]，为什么DRB可以在OPM2细胞中导致细胞凋亡而在U266细胞中不能激活细胞凋亡通路？这可能是因为在两个细胞中激活细胞凋亡的分子机制的关键蛋白的表达并不完全一致。另一种可能的解释是DRB可能有多个靶蛋白，其中某些靶蛋白在U266细胞中并不表达而在OPM2细胞中有表达，从而导致细胞凋亡的不同激活路径。另外，为什么DRB对OPM2和U266细胞中凋亡酶的激活不同，但是DRB均可降低这两个细胞的活力[13]？一个可能的解释是DRB通过其它的机制如增加活性氧化物等来影响U266细胞的活力。

本研究中我们发现调控骨髓瘤细胞死亡的关键蛋白锌指转录因子IKZF1在不同的骨髓瘤细胞中受激酶抑制剂DRB的调控完全不同。通过蛋白质免疫印迹及凋亡酶抑制和激活实验，我们发现DRB对caspase- 3的不同激活是导致IKZF1蛋白在OPM2和U266细胞中受到不同调控的原因。我们的这一研究为探索耐药性骨髓瘤的治疗提供了一定的理论基础。

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Mechanistic study of a kinase inhibitor DRB on the regulation of a zinc finger transcription factor IKZF1 in multiple myeloma cells

LIU Qing，JIANG Xiao- gang

(CollegeofPharmaceuticalSciences，SoochowUniversity，Suzhou215123，China)

Objective： To explore the molecular mechanism by which a kinase inhibitor regulates the protein level of a zinc finger transcription factor IKZF1， which plays critical roles in determining the death of multiple myeloma cells. Methods: IKZF1 in two myeloma cells OPM2 and U266 treated by DRB for different time was determined by western blotting. The procaspases， caspases， proapoptotic and antiapoptotic proteins were immunoblotted. IKZF1 was also monitored in U266 cells treated with fisetin in the absence or presence of caspase inhibitors. Results: IKZF1， procaspase- 9/3 and BID were cleaved in OPM2 cells but not in U266 cells after DRB treatment. Activation of apoptosis with fisetin in U266 cells also led to the cleavage of IKZF1. The cleavage of IKZF1 in two myeloma cell lines was blocked by caspase inhibitors. Conclusion: Activation of apoptotic pathway in two myeloma cells OPM2 and U266 leads to the cleavage and degradation of IKZF1．

multiple myeloma; IKZF1; caspase; DRB; fisetin

2016- 05- 09

2016- 06- 21

国家自然科学基金面上项目(31270874)

刘青(1990-)，女，安徽阜阳人，在读硕士研究生。E- mail:cyan1029@126.com

蒋小岗 E- mail:jiangxiaogang@suda.edu.cn

刘青，蒋小岗.激酶抑制剂DRB在骨髓瘤细胞中调控锌指转录因子IKZF1的机制研究[J].东南大学学报:医学版，2016，35(6)：847- 853.

R967

A

1671- 6264(2016)06- 0847- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．005