糖原合酶激酶- 3β在川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

吕磊，郭华，张洁，徐军

(南京军区南京总医院 干部心内科，江苏 南京 210002)



·论 著·

糖原合酶激酶- 3β在川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤保护中的作用

吕磊，郭华，张洁，徐军

(南京军区南京总医院 干部心内科，江苏 南京 210002)

目的:探讨川芎嗪对在体大鼠缺血再灌注(IR)损伤心肌的影响以及糖原合酶激酶- 3β(GSK- 3β)在其中的作用。方法:40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、IR对照组、川芎嗪组、川芎嗪+渥曼青霉素组以及渥曼青霉素组，每组8只。假手术组冠状动脉左前降支不结扎，余各组均结扎左前降支，松结后直接再灌注。再灌注末，测定血浆心肌酶水平及缺血心肌组织腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量，采用电子显微镜观察缺血心肌超微结构变化，蛋白质印迹法测定缺血心肌组织磷酸化Akt(p- Akt)和磷酸化GSK- 3β(p- GSK- 3β)的蛋白表达水平。结果:IR对照组血浆心肌酶升高，缺血心肌组织ATP含量减少，线粒体损伤。川芎嗪组心肌酶释放减少，ATP含量增加，心肌细胞线粒体超微结构损伤明显减轻，p- Akt和p- GSK- 3β水平显著增高。渥曼青霉素减弱了川芎嗪对IR心肌的保护作用并抑制了川芎嗪所致的p- Akt和p- GSK- 3β蛋白水平的增加。 结论:川芎嗪预处理能减少在体大鼠心肌IR所致心肌酶释放和ATP下降，减轻线粒体损伤，PI3K/Akt- GSK- 3β信号通路参与介导该保护作用。

川芎嗪； 缺血再灌注； 糖原合酶激酶- 3β； 线粒体； 大鼠

如何减轻心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤一直是冠心病治疗中关注的问题[1]。糖原合成酶激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3β，GSK- 3β)是调节糖原代谢的关键酶，近年研究发现，GSK- 3β与心肌IR损伤密切相关，是许多心肌保护措施发挥保护作用的最终共同机制[2]。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中药川芎的有效单体成分，动物模型研究提示TMP有抗氧化，减少心、肾、脑IR损伤的作用[3- 5]，但其减少心肌IR损伤的确切机制尚不明确。本研究旨在观察TMP对在体大鼠IR损伤心肌的超微结构、血清酶和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量的影响，初步探讨GSK- 3β在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组

实验动物选用健康雄性SD大鼠(南京军区南京总医院实验动物中心提供)共40只，体重260～300g，随机分成5组，每组8只。(1) 假手术组(Sham组)：开胸仅穿线不结扎前降支。(2) 缺血再灌注对照组(IR对照组)：开胸结扎冠状动脉左前降支，缺血35min，松结后恢复再灌注120min。(3) TMP组：缺血前5min静脉注射TMP(中国药品生物制品检定所)10 mg·kg-1，余同IR对照组。(4) TMP+渥曼青霉素组(TMP+Wort组)：缺血前5min静脉注射TMP 10 mg·kg-1，再灌前15min静脉注射磷脂酰肌醇- 3- 激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)抑制剂渥曼青霉素(美国Sigma- Aldrich公司)15μg·kg-1，余同IR对照组。(5) 渥曼青霉素组(Wort组)：再灌注前15min静脉给予渥曼青霉素15μg·kg-1，余同IR对照组。

1.2 在体大鼠IR模型制备和标本采集

SD大鼠称重后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，气管切开后接小动物呼吸机(TKR200C型，江西特立麻醉呼吸设备公司)，持续监测Ⅱ导联心电图。开胸依次剪开纵隔胸膜和心包膜，左心耳根部下方进针，5- 0无损伤缝线贯穿左前降支并结扎，以心电图QRS波增宽和J点上抬以及左室前壁紫绀为结扎成功标志。35min后剪断结扎线，心肌再灌注120min。再灌注末抽取大鼠右房血2ml，室温下3000r·min-1离心5min，生化分析仪(7600型，日本日立公司)检测肌酸磷酸激酶同工酶(CK- MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平。左心室缺血心肌组织保存于-80℃冰箱。

1.3 心肌组织超微结构观察

再灌注末心脏快速放血处死大鼠，取出心脏生理盐水冲洗，每组随机取材1～2份，留取左室缺血中心区同一部位行电镜检测。切取1mm3心肌组织，戊二醛固定液中低温固定，1%锇酸固定后脱水，环氧树脂包埋，超薄切片并电子染色，透射电子显微镜(JEM- 1011，日本JEOL公司)进行心肌超微结构观察并拍照。

1.4 ATP含量的测定

严格按ATP试剂盒(南京建成生物工程公司)说明书操作步骤进行，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，计算每g蛋白中的ATP含量。

1.5 蛋白质印迹法测定心肌组织中p- Akt、Akt、p- GSK- 3β和GSK- 3β含量

大鼠心肌组织匀浆，裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，美国Thermo Scientific公司)冰上裂解，提取缺血心肌组织总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。心肌组织蛋白煮沸后聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电转至聚偏二氟乙烯膜，室温下2%脱脂奶粉缓冲液封闭，加入相应一抗(p- Akt、Akt、p- GSK- 3β和GSK- 3β)(美国Cell Signaling Technology公司)封闭，4℃过夜。辣根过氧化酶标记的二抗(1∶5 000稀释)封闭液室温孵育2h，洗涤缓冲液洗膜后行发光检查，暗室曝光分析，采用Gel Doc2000凝胶图像专用软件(Bio- Rad公司)分析目标条带的光密度值，分别以p- Akt/Akt、p- GSK- 3β/GSK- 3β的值反映p- Akt和p- GSK- 3β的相对活化水平。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用One- way ANOVA单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌酶谱检测结果

Sham组大鼠血清CK- MB、LDH水平分别为(873.7±146.3)和(390.5±108.4) U·L-1；IR对照组CK- MB、LDH水平分别为(5238.7±829.8)和(1673.8±141.4) U·L-1，较Sham组明显升高(P<0.05)。与IR对照组相比，TMP组CK- MB和LDH水平下降(均P<0.05)。合用渥曼青霉素后，TMP+Wort组CK- MB水平与TMP组比较明显增高(P<0.05)，单独给予渥曼青霉素时，CK- MB和LDH水平与IR对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 心肌ATP含量

Sham组和IR对照组大鼠缺血心肌组织ATP含量分别为(203.9±32.5)和(114.8±30.1) μmol·g-1，差异有统计学意义(P<0.05)。与IR对照组相比，TMP组ATP含量升高(P<0.05)，TMP+Wort组与Wort组的ATP含量分别为(84.6±18.5)和(76.4±15.7) μmol·g-1，与IR对照组相比，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清心肌酶及心肌组织ATP 含量变化( x ± s)

Tab 1 The levels of serum myocardial enzyme and ATP content in each group( x ± s)

组 别nLDH水平/U·L-1CK-MB水平/U·L-1ATP含量/μmol·g-1Sham组6390.5±108.4ab873.7±146.3ab203.9±32.5abIR对照组61673.8±141.4b5238.7±829.8b114.8±30.1bTMP组61062.7±162.4a3598.3±841.5a155.2±35.5aTMP+Wort组61208.3±156.6a4128.0±882.3b84.6±18.5bWort组61458.7±235.6b5379.3±1170.5b76.4±15.7b

与IR对照组比较，aP<0.05；与TMP组比较，bP<0.05

2.3 心肌组织超微结构改变

电镜下Sham组大鼠心肌细胞结构完整，肌节整齐，肌丝清晰，线粒体膜完整，嵴清晰(图1A)。IR对照组电镜下部分心肌纤维排列紊乱，线粒体肿胀明显，变性，嵴模糊、絮状改变或消失，部分空泡化(图1B)。TMP组线粒体轻度水肿，嵴尚完整，部分线粒体嵴较模糊，少部分线粒体嵴消失、絮状改变或空泡变性(图1C)。TMP+Wort组及Wort组电镜下均可见大部分线粒体肿胀变性，嵴模糊、絮状改变或消失(图1D、E)。

2.4 p- Akt和p- GSK- 3β的蛋白表达情况

TMP组p- Akt蛋白相对表达水平为1.44±0.28，IR对照组为0.80±0.19，二者差异有统计学意义(P<0.05)，TMP组p- GSK- 3β水平较IR对照组亦明显增高(1.92±0.34vs0.64±0.24，P<0.05)。合用渥曼青霉素后，TMP+Wort组p- Akt和p- GSK- 3β蛋白相对表达水平分别为0.55±0.23和1.04±0.26，较TMP组下降(均P<0.05)。单用渥曼青霉素时，p- Akt和p- GSK- 3β分别为0.63±0.25和0.87±0.29，与IR对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05)。见图2。

3 讨 论

心肌是体内对氧供需求最高的组织，含有丰富的线粒体，对IR损伤尤为敏感。IR时细胞及细胞器水肿，以线粒体变化最为明显。心肌IR时细胞ATP酶活性下降，ATP供应不足，钙离子内流增加导致钙超载，同时氧自由基大量生成，线粒体结构和功能受损，心肌细胞能量代谢障碍，进一步加重细胞损伤[6- 7]。本研究观察心肌细胞超微结构，发现电镜下IR对照组大鼠缺血心肌细胞线粒体肿胀，嵴模糊、絮状改变甚至空泡变性，心肌ATP含量较Sham组也有明显下降。而TMP预处理后，线粒体损伤减轻，ATP含量增加，提示TMP保护了心肌。此外，TMP组大鼠血浆CK- MB和LDH水平均明显低于IR对照组，说明TMP预处理可以减少心肌酶释放，保护缺血心肌。

图1 各组大鼠心肌电镜结果

Fig 1 Electron microscope images of myocardium in each group

1.Sham组；2.IR对照组；3.TMP组；4.TMP+Wort组；5.Wort组与IR对照组相比，aP<0.05；与TMP组相比，bP<0.05

图2 蛋白质印迹法检测心肌p- Akt和p- GSK- 3β的蛋白表达

Fig 2 Western blot analysis of Akt and GSK- 3β phosphorylation

PI3K广泛存在于细胞中，是与细胞凋亡和能量代谢等密切相关的胞内信号转导的重要分子。蛋白激酶B(protein kinase B，也称为Akt)是PI3K下游的直接和最主要的靶酶，负责由PI3K始动的生物信息的传导。大量研究表明，再灌注之初PI3K/Akt信号通路的激活能减少心肌梗死面积，促进心肌细胞存活，被认为是再灌注挽救激酶信号通路(RISK信号通路)的重要组成部分[8]。缺血预处理、缺血后处理均能在缺血后和再灌注初期主动募集PI3K/Akt信号转导通路，Akt被激活并转运至胞质和胞核，磷酸化各种底物蛋白，进一步激活下游靶点产生生物学效益，从而保护心肌[9]。本研究发现川芎嗪组p- Akt的蛋白表达水平明显增加，而PI3K抑制剂渥曼青霉素能阻断TMP所致的p- Akt的增加，提示TMP激活了PI3K/Akt信号通路。

GSK- 3β是一种进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛表达于所有的真核细胞中，不仅是调节糖原代谢的关键酶，还与调控细胞分化增殖、存活凋亡有关。GSK- 3β主要位于心肌细胞胞质，生理状况下呈持续活化状态。IR时，氧化应激等因素诱导GSK- 3β易位至线粒体，抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放。GSK- 3β是RISK信号通路中PI3K/Akt和细胞外信号调节激酶1/2等多种细胞保护信号通路的共同下游激酶，Akt的激活能激活GSK- 3β，使其N- 末端丝氨酸(Ser9)残基磷酸化，抑制其活性。磷酸化GSK- 3β能通过直接与mPTP亚单位腺嘌呤核苷酸转运蛋白结合提高mPTP开放的阈值从而抑制mPTP开放，保护线粒体内膜完整性，被认为是抑制mPTP开放的决定性因素之一[2，10]。动物模型研究证实，缺血预适应、缺血后适应等机械干预和促红细胞生成素、异氟烷等药物预处理等心肌保护措施均能增加心肌线粒体p- GSK- 3β水平，提高mPTP开放阈值，保护心肌[10- 12]。本研究通过蛋白质印迹法测定p- GSK- 3β水平，结果发现TMP可显著增加缺血心肌组织p- GSK- 3β水平，渥曼青霉素能抑制TMP所致的Akt和GSK- 3β磷酸化，提示PI3K/Akt信号通路参与了TMP所致的GSK- 3β磷酸化过程。TMP组大鼠CK- MB水平明显低于IR对照组，ATP含量高于IR对照组。而TMP+Wort组较IR对照组无显著差异，提示渥曼青霉素能减弱TMP对IR心肌的保护作用。因此，本实验证实，TMP可以减少在体大鼠心肌IR所致心肌酶释放，增加心肌ATP含量，减轻心肌细胞线粒体损伤，该保护作用可能与激活PI3K/Akt- GSK- 3β信号通路、抑制GSK- 3β的活性有关。

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The role of glycogen synthase kinase 3β in the protective effect of ligustrazine on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

(DepartmentofGeriatricCardiology，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLA，Nanjing210002，China)

Objective： To observe the effect of ligustrazine(tetramethylpyrazine，TMP) on myocardial ischemia reperfusion(IR) and to discuss the role of glycogen synthase kinase 3β(GSK- 3β) in a rat IR modelinvivo. Methods: Forty male SD rats were randomly divided into Sham，IR control，TMP，TMP+Wortmannin(wort) and Wort group.The left anterior descending artery(LAD) was not ligated in the Sham group.LAD in other groups was ligated for 35 min followed by 120 min of reperfusion.The activities of creatine kinase MB fraction(CK- MB) and lactate dehydrogenase(LDH) and the content of myocardial ATP were measured at the end of reperfusion.Electron microscopic evaluation was conducted.Expression of phosphorylated Akt and phosphorylated GSK- 3β were detected by Western blot.Results: The level of plasma CK- MB and LDH increased and ATP content decreased in the IR control group while the mitochondria were damaged.Compared to the IR control group，pretreatment with TMP markedly decreased plasma CK- MB and LDH，increased ATP content，attenuated mitochondrial injury，and induced Akt and GSK- 3β phosphorylation.However，wortmannin attenuated the TMP- induced phosphorylation of Akt and GSK- 3β and abolished the cardioprotective effect of TMP. Conclusion: Ligustrazine pretreatment attenuates myocardial IR injury and mitochondrial injury through decreasing the myocardial enzyme release and boosting ATP level.This cardioprotective effect of ligustrazine is mediated through activating the PI3K/Akt- GSK- 3β signal transduction pathway.

ligustrazine; ischemia reperfusion; glycogen synthase kinase 3β; mitochondria； rats

2016- 06- 18

2016- 09- 02

南京军区南京总医院科研基金资助项目(2014061)

吕磊(1978-)，女，安徽黄山人，副主任医师，医学博士。E- mail：lvleimm@hotmail.com

徐军 Email:xxujun305@sina.com

吕磊，郭华，张洁，等.糖原合酶激酶- 3β在川芎嗪对心肌缺血再灌注损伤保护中的作用[J].东南大学学报:医学版，2016，35(6)：836- 840.

R331.31； R33- 33

A

1671- 6264(2016)06- 0836- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06．003