仔猪水肿病大肠杆菌O8型的分离与鉴定

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600）

仔猪水肿病大肠杆菌O8型的分离与鉴定

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600）

对山东东营某猪场送检的病死猪进行病原菌分离，对分离细菌进行形态学观察、生化试验、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。染色镜检、生化试验结果及PCR试验证实成功分离到一株O8型大肠杆菌，药敏试验结果证实该菌株具有多重耐药性，致病性试验中该菌株对昆明系小白鼠、仔猪均具有一定的致病性。

大肠杆菌；分离；鉴定

仔猪大肠杆菌病是由某些血清型大肠杆菌引起的肠道毒血症，是由致病性大肠杆菌引起的猪常见传染病，主要包括仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病[1-2]。猪水肿病多发于断奶仔猪，尤其是生长快、体况健壮的仔猪最为常见，该病发病率不高，但病死率很高[3]，给养猪业造成很大损失[4]。2016年2月，山东东营某猪场断奶仔猪四肢出现不能站立、共济失调、倒地、四肢呈划水状运动等神经症状，眼睑和颈部水肿。剖检可见肠系膜水肿、胃壁呈胶冻样水肿、肠系膜淋巴结呈串珠状肿大、下颌淋巴结水肿、肺脏淤血水肿、胆囊水肿、肾包膜水肿。笔者无菌操作取病死猪的肝脏和肠系膜淋巴结进行分离鉴定，成功分离到一株O8型大肠杆菌，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料、试剂和试验动物

无菌采取病死猪肝脏、肠系膜淋巴结等病料。草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石炭酸复红染液、血琼脂平板、普通营养琼脂平板、麦康凯营养琼脂培养基和肉汤液体培养基均由山东绿都生物科技有限公司质检部提供。DL 2 000 Marker、TagDNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，药敏纸片、糖发酵管及生化试验用各种试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。大肠杆菌O型单价阳性标准血清购自中国兽医药品监察所。10只18～22 g清洁级昆明系小鼠购自山东省实验动物中心，30日龄断奶仔猪购自滨州周边猪养殖户。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中登录的大肠杆菌16S rRNA基因序列，设计1对引物，上游引物：5′-TGGCGG ACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCA CCTTCCTC-3′，扩增的基因序列为1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 细菌检测与分离培养

将无菌采取的病死猪肝脏、肠系膜淋巴结病料涂片或触片、干燥、固定，革兰氏染色、镜检，观察有无细菌及其形态特征，然后将病料划线接种于血液琼脂平板，37℃培养24 h，对可疑菌落进行涂片，革兰氏染色镜检。挑取单个可疑菌落接种于普通肉汤培养基、麦康凯营养琼脂培养基和营养琼脂培养基上，37℃培养24 h，观察生长情况，对可疑菌落进行涂片，革兰氏染色镜检[5]。

1.4 生化鉴定

分别将分离菌经24 h营养琼脂平板纯培养后，进行糖发酵试验及其他生化试验。

1.5 PCR鉴定

挑取麦康凯营养琼脂上单个菌落作为PCR的模板，进行PCR扩增。反应体系（50 μL）：10×Buffer（含氯化镁）5 μL，上、下游引物各2 μL（20 pmol/L）。dNTP 4 μL，TagDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，加水补足至50 μL。扩增反应程序：94℃5 min；94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，30个循环，72℃7 min。取5 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。回收PCR产物，连pMD18-T载体，转化感受态DH5α，挑单菌落，振摇培养过夜，提取质粒，再次鉴定，将鉴定阳性的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 药敏试验

采用药敏纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）进行，方法如下：将分离菌18 h肉汤纯培养物做10倍稀释，用无菌棉签均匀涂布于麦康凯营养琼脂平板上。用无菌眼科镊子将药敏纸片轻轻紧贴于平板上，使纸片之间距离适当，置37℃培养16～18 h后观察结果并测量抑菌圈直径。

1.7 O抗原血清型鉴定

从麦康凯琼脂平板上挑取单菌落，接种于肉汤培养基，37℃振荡培养24 h，离心取沉淀，加入灭菌的0.5%石炭酸生理盐水制成菌悬液，置于121℃下高压2 h，作为待检抗原，取制备的待检抗原和大肠杆菌O抗血清各10 μL，在玻璃板上混匀，同时设生理盐水对照，观察并记录反应结果，30 s内出现明显凝集则判为阳性，否则为阴性。

1.8 致病性试验

1.8.1 小白鼠致病性试验将10只小鼠随机分成2组，分别为试验组和对照组，每组5只。试验组取37℃24 h肉汤纯培养物（含菌量9×108CFU/mL）腹腔注射接种18～22 g小白鼠，0.2 mL/只；对照组小白鼠腹腔注射肉汤0.2 mL/只。注射后小白鼠隔离饲养，观察发病及死亡情况，并对死亡小白鼠进行细菌分离。

1.8.2 猪致病性试验用上述菌液，选择30日龄家猪6头，平均分成2组，每组3头，试验组每只肌肉注射1.0 mL分离菌纯肉汤培养物，对照组每只皮下注射1.0 mL无菌肉汤。隔离饲养，观察猪发病及死亡情况，并对死亡猪肝脏、肠系膜淋巴结等涂片染色镜检，再次进行细菌分离。

2 结果与分析

2.1 细菌检测与分离培养结果

肠系膜淋巴结、肝脏触片革兰氏染色镜检，可见两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。37℃培养24 h后，在血琼脂平皿上有边缘整齐、光滑、湿润、半透明的圆形菌落生长。在麦康凯琼脂培养基上为边缘整齐、表面光滑、湿润、圆形、桃红色菌落。营养琼脂培养基上也有圆形、半透明菌落，肉汤培养基呈均匀浑浊状。分别挑取单个菌落和浑浊菌液涂片进行革兰氏染色，镜检为中等大小、两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。

2.2 生化试验结果

由表1可知，该分离株能发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇，不能发酵肌醇、卫矛醇、赤鲜醇、菊糖，V-P试验阴性，M-R试验阳性，靛基质试验阳性，氧化酶、尿素酶阴性，硫化氢试验阴性，与大肠杆菌的生化特征一致。

表1 分离菌的生化试验结果

2.3 PCR鉴定

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 091 bp，与预期结果一致（图1）。PCR产物与pMD18-T连接后，送公司测序。测序结果与GenBank登录的大肠杆菌16S rRNA基因的相似性为100%。

图1 大肠杆菌分离株PCR检测结果

2.4 药物敏感性试验结果

由表2可知，分离菌对左氧氟沙星、头孢曲松、新霉素、氟苯尼考高敏，对四环素、卡那霉素、环丙沙星中敏，对青霉素G、强力霉素、泰乐菌素、红霉素、链霉素、氨苄西林、磺胺甲氧嘧啶耐药。

表2 分离菌株的药物敏感性试验结果mm

2.5 血清型鉴定结果

玻片凝集试验结果显示，该菌的O抗原血清型为O8。

2.6 致病性试验

2.6.1 小鼠致病性试验试验组小白鼠注射分离菌6 h后出现眼睑、面部水肿、精神委靡、食欲不振，同时伴有共济失调、麻痹等神经症状，48 h内全部死亡。剖检小鼠肝脏和脾脏肿大、肺脏有点状出血，胃壁和肠系膜浆液性水肿、肠黏膜出血。其他脏器未见明显眼观病变。取攻毒死亡小鼠肝脏和肠系膜淋巴结等划线接种于麦康凯平板，涂片染色，镜检发现为革兰氏阴性短小杆菌。对照组小白鼠未见异常。

2.6.2 家猪致病性试验试验组家猪攻毒后12 h可见精神委靡，猪眼睑和颈部高度水肿、不能站立、呈划水状运动，剖检可见胃壁水肿、尤其是胃大弯水肿严重，肠系膜水肿、全身淋巴结水肿，肺水肿、心脏水肿。4 d内全部死亡，取死亡猪肠系膜淋巴结、肝脏等分离细菌、涂片，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性短小杆菌。菌落PCR结果显示，在1 091 bp左右有特异性条带，说明从病变组织中分离到大肠杆菌。对照组家猪无任何临床症状，剖检发现各组织器官正常。

3 讨论

选择细菌性疾病病原分离时，要选择有代表性的病例，并且最好是最近1周未经抗生素治疗的病猪，无菌操作采样，保证用于细菌分离的病料无人为污染，必须新鲜运送，保证整个过程病料始终处于低温状态。

由于养猪场长期用药不规范及饲料中抗生素的大量添加，使猪大肠杆菌的抗药性日益严重，给猪大肠杆菌病的治疗造成很大的困难。药敏试验结果表明，该分离株对左氧氟沙星、头孢曲松、新霉素、氟苯尼考高度敏感，因此，可选取这些药物进行治疗以提高疗效，多种药物交替、轮换使用，避免再次产生耐药性。建议以后如果猪场有细菌病暴发，都要将细菌分离鉴定，并进行药敏试验，以便有针对性的用药，使猪场损失降低。

对畜禽传染病应该坚持防重于治的原则，以预防为主。猪大肠杆菌病也是如此，日常应加强饲养管理，注意防寒保暖，减少天气变化、营养因素等外界条件对猪的影响，提高猪的抗病能力，同时做好消毒与灭蝇、灭蚊工作，保持猪场清洁卫生。大肠杆菌血清型众多，对家猪致病的大肠杆菌血清型有O2、O8、O138、O139、O141等，各血清型之间交叉保护性效果不好。临床中大肠杆菌优势血清型具有一定的区域性，可以筛选优势血清型且具有良好免疫原性的菌株制备多价苗进行免疫预防。

[1]刘峰，张进，刘毅.猪大肠杆菌病防治研究进展[J].湖南畜牧兽医，2010（6）：1-3.

[2]吴文福，巫月生，赖月辉，等.猪大肠杆菌病的流行特点[J].广东畜牧兽医科技，2001，26（1）：13-15.

[3]谢金文，董林，苗立中，等.猪水肿病大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2011（3）：121-122.

[4]陈溥言.兽医传染病学[M].北京：中国农业出版社，2006：111-119.

[5]胡桂学.兽医微生物学实验教程[M].北京：中国农业大学出版社，2006：35-38.

（编辑：富春妮）

伸筋拉骨益寿延年

常言道：“筋长一寸，寿延十年。”我在练习气功时，充分注意到了伸筋和拉骨。这样做的好处是使全身舒展，又可以打通经络。在《鹤翔庄气功》中，第一节六方和合，两手掌向上，两手臂尽量向前伸展，这样反复做3遍，接着做下一个动作，两手臂回收，再向左右伸展，手掌还是向上，这一举和一伸，都要伸展尽量充分，这样就做到了伸筋和拉骨。当然，两手臂在做回收和舒展时，要紧密地配合呼吸，呼吸要细、长、匀、缓。在一呼一吸中，练功者就吸收了天地中的精华，同时也排出了全身的废气。

同样，在乒乓球运动中，我也着重练习伸筋拉骨的动作。例如，乒乓球运动的技术动作正拉弧圈球与直板横打，最能说明问题。正接弧圈球与直板横打的技术要领是用球拍的正上部击球，要求吸球、拉球与发力一气呵成，右臂尽量往上拉（小臂一定要超过肩的高度），这样拉过去的球速度快、旋转快，失误也少。手臂尽量往上拉的过程就是伸筋拉骨的过程。运动中，拉动了手臂外侧的小肠经，也拉动了手臂上的肺经、心经、大肠经和心包经，这些经络都被打通了。这两项技术在乒乓球运动中是使用频率很高的技术，平均每分钟要做四五次，打1个小时的乒乓球，大约要做200次。这200次的运动对手臂部位的各经络进行了疏通和调理，就对消化、循环、泌尿、内分泌和呼吸系统起到了很好的调理作用。

（摘自《中老年保健》2015-12范良善/文）

Isolation and Identification of Escherichia coli Serotype O8 from Edema Disease of Pigs

LI Tianzhi,YU Xinyou
(Shandong Lvde Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

The pathogen was isolated on a dead pig from a Shandong Dongying farm.The serotype O8 Escherichia coli was confirmed by morphological observation,biochemical test,PCR assay,drug sensitive test and animal infection experimen.Results showed the isolates with multidrug-resistant,had certain pathogenic to Kunming mice and weaning pigs.

Escherichia coli;isolation;identification

S858.282.61+5

A

1002-1957(2016)04-0118-03

2016-06-25

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）；山东省自然科学基金项目（ZR2014CQ012）

李天芝（1985-），女，山东菏泽人，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断技术研究工作.E-mail:517493935@qq.com