多重PCR检测肺炎链球菌血清型方法及临床应用＊

吴丽娟 邹建话 刘小月 郑 磊 王 前

吴丽娟1，2，邹建话1，刘小月1，郑 磊3，＊，王 前3，＊

1 广东省深圳市宝安区妇幼保健院检验科，深圳518133； 2南方医科大学检验系，广州510515； 3南方医科大学南方医院检验科，广州510515； ＊通讯作者

肺炎链球菌（Streptococcus Pneumonia，SP）是全球儿童社区获得性感染的首要病原菌，既可导致儿童脓胸、败血症、脑膜炎等侵袭性感染，也可导致中耳炎（SP占30%～60%）、肺炎（SP占30%～50%）等呼吸道感染。我国每年因SP相关性疾病导致儿童死亡人数列全球前10名［1］。SP细胞外的多糖荚膜是其致病的关键，同时也是疫苗作用的靶点，根据荚膜多糖的不同，已经鉴定出46个血清群，93个血清型。SP的血清型既与致病性、耐药性有关，也与荚膜置换、疫苗有效性有关，是相关研究的核心［2］。由丹麦国家血清研究院（Statens Serum Institut，SSI）提供的荚膜肿胀法和乳胶凝集法是传统方法检测SP血清型的金标准［3］，但其抗血清昂贵，不能自动化及批量检测。由于90多种血清型的荚膜多糖基因序列（cps）的公布，分子分型技术有望替代传统方法，更简单快捷地检测SP血清型［4］。本研究旨在建立一种简易的血清型多重PCR（mPCR）方法，检查几种常见重要SP血清型（4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A），通过检测相应已知血清型和未知血清型临床菌株并与测序结果比较，以初步探讨该方法的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

1.1.1 已知血清型SP菌株：4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A（北京大学人民医院惠赠）各1株，血清型由SSI荚膜肿胀法确定。

1.1.2 未知血清型SP菌株：分离自2009年1月～2011年12月深圳市某区妇幼医院儿科患儿不重复SP菌株126株［5］，其中16株来源于血液，其它来源于呼吸道，用苛氧菌菌种保存管（MAST，英国）－70℃保存。SP鉴定标准为奥普托欣纸片敏感和胆汁溶菌试验阳性。

1.1.3 质控菌株：选取标准菌株ATCC49619（已知血清型为19F）作为质控菌株。

1.2 实验试剂与设备

二氧化碳培养箱（Shellab，美国）；Axygen细菌基因组DNA小量提取试剂盒（美国）；Taq DNA聚合酶、d NTP Mix、10×Loading Buffer、DNA Mar ker（Ta Ka Ra公司，日本）；琼脂糖（Biowest公司，法国）；溴化乙锭等常规分子生物学试剂（南方医科大学检验系提供）；TA载体试剂盒（上海拜力公司）；琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Ta Ka Ra公司，日本）；PCR扩增仪（Eppendorf，德国）；凝胶电泳成像分析系统（Bio－rad，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计：参照文献［6］，根据广泛应用的SP 7价结合疫苗覆盖血清型及近年来常见的19 A血清型，设计9对PCR引物，包括SP荚膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9 V、14、18、19 A、19F、23F特异性引物，由Invitrogen公司合成，各引物序列见表1。

1.3.2 DNA提取、PCR扩增：将冻存的SP临床菌株复苏，重传至羊血平板（广州迪景），置5%CO2、35℃温箱孵育18～24h。将新鲜纯SP菌落刮入1 ml生理盐水，按Axygen细菌基因组DNA小量提取试剂盒（柱提取法）步骤提取模板DNA。PCR反应体系为Ex Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×Ex Taq buffer 2μl，模板 DNA 2μl，d NTPs 1.6μl，9种混合引物（每种引物 200μM）0.75μl，重蒸水补足至20μl。循环参数：94℃15 min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶电泳成像系统观察产物条带。

表1 8种特异性SP血清型引物序列

1.3.3 DNA测序：在紫外灯下切割有条带的胶块，按DNA纯化试剂盒说明书对DNA进行纯化后，按TA载体试剂盒说明书与p MD18－T载体进行连接，平板克隆。完成后送华大基因公司测序，测序结果经Blast检索与Gen Bank数据库进行同源性比较分析。

2 结 果

2.1 8株已知血清型SP DNA经mPCR扩增后结果

每株SP都能扩增出cpsA特异性产物，同时每种血清型均在对应的产物大小位置出现特异性条带，血清型18和19 A由于产物大小太接近，无法直接区别，需克隆后测序区分；产物测序结果与mPCR结果一致。见图1。

图1 已知血清型SP经mPCR扩增后电泳图

2.2 126株未知血清型临床SP DNA经mPCR扩增后结果

共有124株SP能扩增出cpsA特异性条带，14株血液来源SP有特异性条带，检出5种血清型，35株呼吸道来源SP有特异性条带，检出8种血清型（表2）。所有血清型特异性条带均经过纯化克隆后测序验证，结果显示与mPCR结果一致。

表2 126株临床SP血清型检出率（n，%）

3 讨 论

cps基因座上的荚膜多糖合成基因决定SP荚膜多糖的产生，其开始部位的基因序列cpsA高度保守，几乎可出现在所有SP中，除外不能分型的SP（无荚膜），cps基因座中心部位的位点包含血清型特异性基因，可作为分子分型的基础［4］。本文设计的mPCR引物针对最常导致侵袭性感染（血流感染）的8种SP血清型的cps保守序列，通过mPCR检测的8种SP血清型与传统方法检测的血清型均一致，可以直接通过产物大小区分特异性血清型，无交叉反应，cpsA可作为内参。表明该方法可简单、直接地区分8种血清型。

SP通过两种不同方式对人体致病：一是侵袭性菌株通过有效的人类个体间传播导致菌血症；二是菌株长期定植在鼻咽部，伺机导致呼吸道感染。因此出现侵袭性感染和呼吸道感染SP血清型的不同流行分布特点。全球范围内，13种SP血清型导致了超过75%的儿童侵袭性SP感染（血流感染）［1］，我国Lian等［3］用传统方法检测儿童血液来源SP血清型发现87.8%的菌株分布在这13种血清型中，尤以血清型19F、14、19A、6和23F最常见。与本研究中血液来源SP 87.50%分布在19F、14、19 A、6和23F相一致，表明mPCR对血液来源SP血清型检测有较高的应用价值，通过一次mPCR即可检测出绝大部分菌株的血清型，简单有效。

本文结果显示本方法对呼吸道来源样本SP的血清型检出率显著低于血液样本，只有31.81%的样本出现特异性条带，这与呼吸道SP血清型异质性大，分布更广有关，仅用一次mPCR不能达到检测目的。对此可采用 Karen等［7］设计的一系列mPCR实验，逐步完成对所有呼吸道样本SP血清型的筛查。

mPCR分子分型法检测SP血清型不用购买昂贵的血清型抗血清，又能达成准确、简单、高通量检测血清型。同时，mPCR还可应用于呼吸道多种血清型SP混合定植的筛查，这是传统方法无法做到的。总之，本文建立的mPCR检测SP血清型方法可简单、直接地检测出8种SP重要血清型，尤其对于血液来源SP血清型有较大优势，至于呼吸道SP血清型检测尚需完善更多mPCR方案。

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4 Stephen DB，David MA，Angeliki M，et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal ser ot ypes［J］.PLoS Genet，2006，2（3）：e31.

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6 Rekha Pai，Robert EG，Ber nard B，et al.Sequential multiplex PCR approach for deter mining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates［J］.J Clin Micro，2006，44（1）：124～131.

7 Karen M，Carolynn DB，Marcella H，et al.Serotyping of streptococcus pneumoniae isolates from nasopharyngeal samples：use of an algorit h m combining microbiologic，ser ologic，and sequential multiplex PCR techniques［J］.J Clin Micr o，2011，49（9）：3 209～3 214.