中国广西人白细胞介素－21基因rs2221903 T／C遗传多态性研究＊

蓝 艳 余艳蓉 王春芳 韦叶生 韦传东 王俊利 黄照权

蓝 艳1，余艳蓉2，王春芳3，韦叶生3，韦传东3，王俊利3，黄照权4，＊

广西壮族自治区百色市右江民族医学院附属医院，百色533000； 1皮肤科； 2烧伤外科； 3检验科； 4病理科； ＊通讯作者

白细胞介素－21 （Interleukin－21，IL－21）是一种新近发现的I类细胞因子，主要由活化的CD4＋T细胞产生，能够调节体液和细胞介导的免疫应答，促进T细胞增殖分化，调节B细胞的增殖与调亡，增强NK细胞的细胞毒性作用［1～3］。此外，IL－21还具有抗肿瘤作用，与其它细胞因子、疫苗等联合应用，有增强其抑制肿瘤细胞生长的功能［4］。IL－21 基因定位于人4号染色体长臂上（4q26～27），转录一条由642个核苷酸组成的成熟mRNA，编码162个氨基酸组成的蛋白前体，其中前31个氨基酸为信号肽，后131个氨基酸组成具有四螺旋结构域，相对分子质量为15k D。目前，有关IL－21基因rs2221903 T／C多态性的研究国内外较少文献报道。因此，本文采用单碱基延伸PCR技术，研究广西地区199例健康人群中IL－21基因单核苷酸多态性（SNP），并与人类基因组计划（Hap map）公布的4组人群（欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人）的SNP分型数据进行比较，以探讨IL－21基因多态性在不同种族正常人群中的分布差异，为人类学及群体遗传学研究提供前瞻性基础资料。

1 资料与方法

1.1 实验对象

随机选取广西地区无血缘关系，在广西右江民族医学院附属医院体检健康人群199例，其中男118例，女81例，年龄25～86岁，各项临床及实验室检查指标均正常。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取：采集以上人群静脉血2 ml，用EDTA－K2抗凝；采用已建立的改良碘化钠法［5］提取白细胞基因组DNA，－70℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成：根据IL－21基因rs2221903 T／C位点多态性和已知的DNA序列设计PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增IL－21基因包含rs2221903 T／C位点碱基的DNA片段的引物，上游引物序列为：5’－TGG ACA CTG ACG CCC ATA TTG A－3’，下游引物序列为：5’－AAG GCA GTT TAG TGG YGA CAG C－3’，延 伸 引 物 为：5’－TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG CTC TGC TGC TTG CAG AAC A－3’。1.2.3 PCR 扩增：IL－21的 PCR扩增反应体系为20μl，其中含10×PCR 缓冲液2.0μl，0.3 mmol／L d NTPs 2.0μl，上、下游引物各1.0μl，模板 DNA 1.0μl，Taq DNA聚合酶1.0 U，不足体积用灭菌双蒸水补足。PCR扩增程序：95℃预变性2 min，94℃变性20s，65℃退火40s，72℃延伸1.5 min，11个循环；94℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸1.5 min，24个循环；72s延伸2 min，4℃保存。PCR产物用Qiagen公司的Hot Star Taq进行多重PCR获得，经虾碱酶（SAP）（pro mega公司，美国）和外切酶I（EXOI）（Epicentre公司，美国）纯化后用 ABI公司的SNa PshoTMultiplex Kit进行延伸反应。PCR延伸程序：96℃预变性1 min，96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环，4℃保存。延伸产物测序：取0.5μl延伸产物，用SAP纯化，95℃变性5 min后上ABI 3130 XL测序仪进行测序，测序结果见图1。SNP 分型用 Gene Mapper4.0（Appliedbiosyste ms）分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.5软件包进行统计分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 广西人IL－21基因型检测结果

IL－21基因rs2221903 T／C多态性，PCR扩增产物片段大小为230bp。经ABI 3130XL基因检测仪SNP分型，结果显示广西人IL－21基因rs2221903 T／C位点检测到TT、TC和CC三种基因型。

2.2 广西人IL－21基因多态性分布

IL－21基因rs2221903 T／C位点的基因型及等位基因频率符合Hardy－Weinberg遗传平衡，说明所选研究样本具有群体代表性。其中rs2221903 T／C位点基因型以TT型最为常见，占75.38%；其等位基因以T型频率最高，占87.19%。其基因型频率分布的男女性别间比较无统计学差异（P＞0.05），见表1。

2.3 IL－21基因多态性在不同种族人群中的分布比较

将广西人IL－21基因rs2221903 T／C多态性分布频率与人类基因组计划 （htt p：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／projects／SNP／）公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人的SNP分型数据进行比较，发现中国广西人基因型及等位基因的分布频率与欧洲人和非洲人比较具有统计学差异（P＜0.05），而与日本人和中国北京人比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与中国安徽人［6］比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图1 IL－21基因rs2221903 T／C测序图

表1 IL－21基因型及等位基因频率在广西地区人群中的分布（n，%）

表2 不同种族及地区人群IL－21基因rs2221903 T／C多态性分布频率比较（n，%）

3 讨 论

随着人类基因组研究的进展，已经认识到不同的基因背景可以造成人们对某些疾病不同的易感性。通过对人类基因多态性的研究可以了解各种基因的不同基因型在人群中的分布，有助于从基因水平更深刻地阐明各种疾病在不同种族、不同人群中存在不同发病率和不同临床表现、临床特点的内在机制。因此，基因多态性的研究是解释多种疾病临床表现多样化的一个有用工具。而在对一些致病基因的多态性分布进行研究时，首先了解其在正常人群中的分布特点是正确分析基因多态性与疾病之间关系的前提条件。

IL－21是一类由激活的CD4＋T细胞和自然杀伤T细胞（NKT）分泌产生的I型细胞因子，大量研究发现，IL－21是一个重要的免疫调节分子，通过与其受体（IL－21R）特异性结合而发挥广泛的生物学作用，如抗病毒、抗肿瘤、调节免疫应答等［7～9］。IL－21基因位于4号染色体长臂上（4q26～27），包括5个外显子和4个内含子，IL－21基因存在单核苷酸多态性，这种基因多态性可能影响IL－21基因的功能，进而可能影响到IL－21基因多态性与相关疾病的发生发展。Ding等［6］和Sawalha等［10］研究发现，IL－21基因多态性与系统性红斑狼疮发病显著相关。Jia等［11］研究发现，在格雷夫斯（氏）病患者中，IL－21等位基因及单倍体与该病发生显著相关。此外，国外学者的研究表明，IL－21基因多态性在I型糖尿病及反复自发性流产发病的遗传因素中起重要作用［12，13］。因此，正确分析和阐明IL－21基因多态性在不同种族和地域人群中的分布特点，为进一步研究不同人群中IL－21基因多态性与某些疾病发生发展之间的关系提供理论依据和分子遗传学基础。

本文应用单碱基延伸PCR技术检测了广西地区正常人群中IL－21基因rs2221903 T／C位点多态性的分布情况，结果显示，在所观察人群中，rs2221903 T／C位点表现出TT、TC和CC三种基因型，以TT型最为常见（75.38%），其等位基因以T最为常见（87.19%）。进一步分析发现，IL－21基因rs2221903 T／C位点基因型分布频率男女组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示该位点基因型分布频率与性别无关。将中国广西地区人与欧洲人、非洲人、日本人、中国北京和安徽等人群基因多态性研究结果比较发现，广西健康人群中IL－21基因rs2221903 T／C位点T等位基因频率（87.19%）显著高于欧洲人（63.72%）、显著低于非洲人（95.58%），差异具有统计学意义（P＜0.05）；而与日本人、中国北京人及安徽人比较差异无统计学意义。从本文结果可以看到，IL－21基因型分布及等位基因频率在不同种族间存在着明显的差异，这一结果符合遗传学规律，即亲缘关系越近，其基因型分布越相似，反之差异越显著。

综上所述，对中国广西人IL－21基因rs2221903 T／C多态性的研究，不仅有利于认识临床上与IL－21基因相关的多种疾病在不同种族和地域表现出来的差异，而且进一步为人类学及群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础，并为疾病前瞻性研究提供了重要的分子遗传学数据。

致谢：感谢上海天昊生物科技有限公司丁达和刘燕两位博士在实验过程中给予的大力支持和帮助！

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