益母草总生物碱对前列腺增生模型大鼠Bcl-2表达的影响

张自刚 刘铁柱 张 宁

(大庆油田总医院泌尿外科，黑龙江 大庆 163001)



益母草总生物碱对前列腺增生模型大鼠Bcl-2表达的影响

张自刚 刘铁柱 张 宁1

(大庆油田总医院泌尿外科，黑龙江 大庆 163001)

目的 探讨益母草总生物碱对前列腺增生模型大鼠抑凋亡因子Bcl-2表达的影响及其对良性前列腺增生(BPH)的治疗效果。方法 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，体重250～270 g，适应性喂养1 w后开始造模。从中随机选取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睾丸酮(溶于橄榄油)50 mg/kg连续4 w，分别为模型组、益母草组及阳性药组，每组10只，余下大鼠注射10 ml/kg橄榄油，位置及时间间隔同模型大鼠，作为对照组。从造模后1 w开始，益母草组高、中、低剂量组分别按2 ml/100 g灌服益母草总生物碱(100、50、25 mg/kg)；阳性药组以同体积灌胃癃闭舒胶囊300 mg/kg(溶于10 ml生理盐水)，模型组和对照组均以等体积的生理盐水灌胃，均每日1次，每周称量一次体重，根据体重调整给药剂量，连续4 w。结果 益母草组和阳性药组均可降低模型大鼠前列腺湿重和前列腺指数，与模型组相比，差异显著(P<0.05)。与阳性药组相比，益母草高、中剂量组下降更显著(P<0.05)。治疗后各治疗组Bcl-2表达均减弱，与模型组相比差异显著(P<0.05)，与阳性药组相比，益母草高、中剂量组治疗后Bcl-2表达减弱更显著(P<0.05)。益母草高、中剂量组前列腺总体形态接近对照组，腺体大小基本一致，有少数增生，极少部分呈乳头状突入腔内，益母草低剂量组可见腺体增多未明显改善，向腺腔内突出，部分上皮细胞呈高柱状，间质和血管充血、水肿明显。阳性药组光镜下可见部分腺腔变大，有一部分呈乳头状向腔内突出，有部分高柱状上皮。阳性药组和益母草组大鼠的前列腺上皮皱褶基本消失，腺腔扩张，间质有所增厚，其比表面(δ)和比膜面(δm)与模型组相比有明显差异(P<0.05)，而益母草高、中剂量组与阳性药组相比也有统计学差异(P<0.05)。结论 益母草总生物碱能够显著降低前列腺增生模型大鼠Bcl-2表达，对BPH的治疗效果明显，值得推广。

益母草总生物碱；前列腺增生；Bcl-2

目前，前列腺增生的发病机制尚不完全清楚，已有的发病学说有激素内分泌学说、细胞凋亡学说、生长因子学说等〔1〕。中医认为前列腺增生的成因是膀胱气化不利、三焦气化失司致湿热瘀血痰浊闭阻膀胱所致〔2〕。益母草是一种常见的中草药，具有活血化瘀、利水通淋之功。现代药理研究表明，益母草具有抑制血小板聚集、抗氧自由基、增强免疫、保钾利尿等作用〔3〕，提示益母草可能具有治疗前列腺增生的功效。高渐联〔4〕研究发现，益母草总生物碱能显著抑制模型动物前列腺增生，并推测其可能是通过调解转化生长因子(TGF)-β1表达水平抑制增生。因此，治疗前列腺增生，抑制细胞增殖是关键。抑凋亡基因Bcl-2是目前仅发现的与BPH密切相关的基因，但目前关于益母草总生物碱治疗前列腺增生对Bcl-2表达的影响尚未见报道。因此本试验通过分析益母草总生物碱对大鼠前列腺细胞凋亡基因表达的影响，为益母草总生物碱治疗前列腺增生提供新证据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠65只，雄性，10～12 w，体重250～270 g，北京维通利华实验动物中心提供。室温20℃左右，相对湿度40%～60%。环境光照12 h暗、12 h明。动物自由饮水进食。

1.2 仪器及试剂 丙酸睾丸酮注射液(上海通用药业股份有限公司)、益母草总生物碱(含量>80%)、癃闭舒胶囊(石家庄科迪药业有限公司)、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉生物工程公司)、 Bcl-2试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、图像采集(德国 Lecia 显微照相系统)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型的建立 大鼠适应性喂养1 w后开始造模，随机选取55只大鼠，隔日皮下注射丙酸睾丸酮50 mg/kg(溶于橄榄油，0.1 ml/100 g )，连续4 w，余下10只大鼠注射10 ml/kg橄榄油，位置及时间间隔与造模大鼠相同。

1.3.2 分组及处理 造模大鼠55只随机分为模型组、益母草高、中、低剂量组及阳性药组，每组10只，剩下5只模型大鼠用于模型的验证。未干预大鼠作为对照组，从造模后1 w开始，益母草组高、中、低剂量组分别按2 ml/100 g灌服益母草总生物碱(100、50、25 mg/kg)；阳性药组以相同体积癃闭舒胶囊300 mg/kg(溶于10 ml生理盐水)灌胃。模型组和对照组均以等体积的生理盐水灌胃，灌胃均每日1次，每周称量一次体重，根据体重调整给药剂量，连续4 w。

1.4 检测指标及观察方法

1.4.1 前列腺湿重及前列腺指数 末次给药后24 h称重，脱颈处死大鼠，立即打开腹部，分离前列腺周围脂肪后摘除前列腺，去除附带组织，用滤纸吸取表面液体，天平称量，计算前列腺指数〔前列腺湿重(mg)/体重(g)×100%〕。

1.4.2 Bcl-2测定 称重完毕后将前列腺组织于4%多聚甲醛溶液中固定20 h，脱水后石蜡包埋，切片，按照试剂盒说明滴加一抗后磷酸盐缓冲液(PBS)清洗标本，再滴加二抗。DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，光学树脂胶封固，医学真彩色计算机图像全自动分析处理系统观察并计算阳性细胞。上皮细胞层中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片中随机选择10个视野，计算Bcl-2蛋白的平均光密度(MOD)。

1.4.3 前列腺病理学形态 将固定后的前列腺组织48 h后常规脱水、石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察其病理学形态变化，测定各组大鼠的前列腺比表面(δ)和比膜面(δm)。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结 果

2.1 模型验证 造模开始后第29天随机选取5只大鼠，处死，下腹部切口，找到膀胱，在其后下方找到前列腺，分离周围脂肪，分离并取出前列腺，固定，石蜡包埋，HE染色，在显微镜下观察，镜下显示前列腺腺泡增多，腺腔呈锯齿扩张明显并出现乳头状增生 (图1)，证明造模成功。

图1 大鼠前列腺组织病理图片

2.2 前列腺湿重及前列腺指数 与对照组相比，模型组大鼠前列腺湿重和指数均降低(P<0.05)。与模型组相比，各治疗组前列腺湿重及前列腺指数均明显下降(P<0.05)；与阳性药组相比，益母草高、中剂量组前列腺湿重及前列腺指数下降更显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠前列腺湿重及前列腺指数±s,n=10)

与对照组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05；与阳性药组相比：3)P<0.05；下表同

2.3 Bcl-2水平变化 与对照组〔(7.74±1.66)%〕相比，模型组大鼠前列腺组织中上皮细胞层Bcl-2有较强阳性表达〔13.68±3.62)%〕(P<0.05)。与模型组相比，益母草各组和阳性药组的Bcl-2表达均减弱〔益母草高、中、低剂量组及阳性药组分别为(8.49±2.59)%、(9.25±1.87)%、(11.93±2.04)%、(10.33±2.70)%,P<0.05〕；与阳性药组相比，益母草高、中剂量组治疗后表达减弱更显著(P<0.05)。见图2。

2.4 病理学改变 对照组光镜下可见前列腺体大小一致、排列整齐，上皮细胞呈单层柱状，表面光滑。模型组可见腺体增多、扩张，向腺腔内突出，上皮细胞呈高柱状，间质和血管充血、水肿。益母草高、中剂量组：前列腺总体形态接近对照组，腺体大小基本一致，有少数增生，极少部分呈乳头状突入腔内；益母草低剂量组可见腺体增多未明显改善，向腺腔内突出，可见部分上皮细胞呈高柱状，间质和血管充血、水肿明显。阳性药组光镜下可见部分腺腔变大，有一部分呈乳头状向腔内突出，有部分高柱状上皮。 见图3。

图2 各组大鼠前列腺细胞Bcl-2免疫组化

图3 大鼠前列腺组织病理切片

2.5 立体计量学改变 对照组大鼠的前列腺几乎没有皱褶，腺腔正常；模型组大鼠前列腺上皮皱褶明显增多，腺腔缩小，间质变薄。阳性药组和益母草组前列腺上皮皱褶基本消失，腺腔扩张，间质增厚，δ和δm与模型组相比有明显差异(P<0.05)。益母草中、高剂量组前列腺上皮皱褶基本消失，腺腔扩张，间质增厚不明显，与阳性药组相比有明显差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠δ和δm比较

3 讨 论

细胞增殖和凋亡的动态平衡维持了器官细胞总数目的恒定。正常前列腺形态也是细胞增殖和凋亡的细胞保持恒定的结果，是在控制下进行的，在正常组织中，细胞增殖速率和细胞死亡速率间存在着平衡，一旦不平衡发生，则表现为细胞的增殖增加或细胞凋亡数目减少。无论是通过细胞复制的增加还是细胞死亡的减少，都会引起前列腺细胞的堆积进而反应为前列腺的增生〔5〕。Bcl-2基因是目前仅发现的与BPH密切相关的基因。以往研究已经证实了Bcl-2基因表达可以抑制细胞的增殖〔6～8〕。本研究首次证明了益母草总生物碱能够显著降低Bcl-2表达，因此推测其可能是通过抑制Bcl-2表达促进了前列腺增生细胞的凋亡，从而达到治疗作用。进一步的病理学检测和立体计量学检测结果显示，益母草总生物碱比阳性药的治疗效果更好。

1 Unterbrink A，O′SullivanM，Chen S，etal.TGF beta-1downregulates DMP-1 and DSPP in odontoblasts〔J〕.Connect Tissue Res，2002;43(2-3)：354-8.

2 Gann PH，Klein KG，Chatterton RT，etal.Growth factors in expressed prostatic fluid form men with prostate cancer，BPH，and clinically normal prostates〔J〕.Prostate，1999；40(4)：248-55.

3 Roberts RO，Jacobson DJ,Girman CJ，etal.Insulin-like growth factor i，insulin-like growth factor binding protein 3，and urologic measures of benign prostatic hyperplasia〔J〕.Am J Epidemiol，May 2003；157(7)：784-91.

4 高渐联.益母草总碱对良性前列腺增生动物模型的作用机理探讨〔D〕.郑州：河南中医学院，2010.

5 王宜梅.益母草的临床应用〔J〕.光明中医，2006；21(2)：11.

6 张学军，马腾骧.Bcl-2基因在良性前列腺增生中的作用〔J〕.中华泌尿外科杂志，1997；18(2)：97-9.

7 刘 洋.中医药治疗良性前列腺增生机理的研究进展与现状〔J〕.中国男科学杂志，2006；20(6)：71-2.

8 洪振丰.良性前列腺增生实验研究的选择指标〔J〕.中华男科学杂志，2008；14(9)：771-4.

〔2015-12-30修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金资助项目(No.81372738)

张自刚(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事泌尿系结石，肿瘤的治疗研究。

R69

A

1005-9202(2016)20-4951-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.005

1 北京大学附属肿瘤医院泌尿外科