丙戊酸钠对APP/PS1转基因小鼠脑内海马区老年斑形成的影响

胡江平 蔡克瑞 金在顺 金花淑 李凯军

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)



丙戊酸钠对APP/PS1转基因小鼠脑内海马区老年斑形成的影响

胡江平 蔡克瑞 金在顺 金花淑 李凯军

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

目的 研究丙戊酸钠(VPA) 对APP/PS1转基因小鼠脑内海马区老年斑(SP)形成的影响。方法 APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和VPA治疗组，VPA治疗后应用免疫组化技术检测APP/PS1转基因小鼠脑内海马区SP的数量及大小。ELISA测定脑组织β淀粉样蛋白(Aβ)的含量变化。结果 VPA治疗组小鼠海马区域出现的阳性SP数目与对照组相比分别显著减少65%，斑块沉积也分别由0.65%降到0.22%(P<0.01)。ELISA结果显示，VPA治疗组小鼠脑内可溶性Aβ的水平(75 pg/mg)较对照组明显下降(92 pg/ml，P<0.05)。结论 VPA可以减少APP/PS1转基因小鼠脑内SP的形成，抑制Aβ的生成。

丙戊酸钠；阿尔茨海默病；APP/PS1转基因小鼠；β淀粉样蛋白

阿尔茨海默病(AD)的病理特征为细胞外β淀粉样蛋白(Aβ) 沉积形成的老年斑(SP)、细胞内磷酸化tau蛋白聚合形成的神经纤维缠结(NFTs) 和选择性胆碱能神经元在学习和记忆相关的脑区的缺失〔1～3〕。抑制老年斑的形成是治疗AD的重要途径之一。丙戊酸钠(VPA)是广泛用于治疗癫痫和情感障碍的抗惊厥药物和情绪稳定剂。VPA作为治疗双相情感障碍的主要药物，能有效控制患者的躁狂和抑郁症状，与锂盐、卡玛西平一起作为情绪稳定剂。VPA可能的作用机制主要包括阻止神经细胞凋亡，通过增加神经发生和刺激星形胶质细胞释放神经营养因子保护神经元等〔4〕。本文探讨VPA对APP/PS1转基因小鼠AD病理改变的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 转基因小鼠购自美国Jackson实验室，通过常规喂养，繁殖后经PCR进行基因型鉴定，鉴定后的转基因小鼠用于实验。小鼠抗Aβ抗体 (Sigma)，小鼠抗GAPDH抗体 (Kangchen)，免疫组织化学SP试剂盒 (福州迈新生物技术开发有限公司)，ELISA试剂盒 (Keregen)。紫外分光光度计，电子天平，水平摇床，Leica石蜡切片机，Olympus光学显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 20周龄APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和VPA治疗组，每组6只。对照组小鼠腹腔注射生理盐水，VPA治疗组小鼠给予50 mg/kg VPA腹腔注射，1次/d，连续12 w。

1.2.2 样本处理 APP/PS1 (APPswe/PSEN1dE9) 转基因小鼠购自美国Jackson实验室，通过常规喂养 (22℃～25℃，50%湿度，12 h光照循环)，繁殖后经PCR进行基因型鉴定，鉴定后的小鼠用于实验。将20周龄的APP/PS1转基因小鼠随机分为对照组和VPA治疗组。VPA治疗组小鼠腹腔注射VPA (50 mg/kg)，1次/d，对照组小鼠给予等量的生理盐水。12 w后，小鼠经麻醉处死取材，脑组织两侧半球分开，右侧脑组织于4%多聚甲醛中固定后石蜡包埋，用于免疫组化分析，左侧脑组织-80℃低温冷冻保存，用于生化检测、ELISA分析等。

1.2.3 免疫组织化学染色 脑组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，PBS溶液冲洗3次；微波煮沸修复抗原，自然冷却后PBS溶液冲洗3次；山羊血清室温孵育1 h，滴加小鼠抗-Aβ抗体 (1∶5 000)，4℃孵育过夜；PBS溶液冲洗3次后滴加生物素-山羊抗小鼠IgG，室温孵育2 h，PBS溶液冲洗3次，滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育1 h；PBS溶液漂洗后DAB显色，用蒸馏水冲洗终止反应；苏木素复染，常规梯度脱水、透明、封片保存。使用Image-Pro Plus软件测量海马内SP数量及斑块沉积，进行统计学分析。

1.2.4 酶联免疫吸附(ELISA)法检测Aβ1～40水平 Aβ1～40含量通过ELISA试剂盒测定，操作按照说明书进行。脑组织超声粉碎，离心后取上清液；用标本稀释液稀释后，每孔分别加入标准品或样品50 μl，加入50 μl生物素标记的抗体，震荡混匀，37℃温育1 h；去除孔内液体，用洗涤液洗涤3次；每孔加入80 μl的亲和链霉素-HRP，震荡混匀，37℃温育30 min；去除孔内液体，用洗涤液洗涤3次；每孔加入底物A、B各50 μl，震荡混匀，室温孵育30 min，37℃孵育10 min，避光；取出酶标板，加入50 μl终止液，酶标仪450 nm波长测OD值，通过标准曲线计算Aβ1～40含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 老年SP数目与斑块沉积 由于APP/PS1转基因小鼠的显著特点是出现明显的记忆缺失，并且脑内SP的数量随着年龄的增加而增多，这与AD患者的神经病理过程基本一致。本实验所用的20周龄APP/PS1转基因小鼠处于SP形成早期，给药12 w后，应用免疫组织化学技术观察各组小鼠脑内SP的数量及大小，在大脑海马等部位的阳性SP呈棕黄色(图1)。VPA治疗组小鼠的大脑海马区域出现的阳性SP数目与对照组相比均显著减少65%，斑块沉积由0.65%降到0.22%，两组差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 脑组织Aβ含量 VPA治疗组小鼠脑内可溶性Aβ的水平为75 pg/ml，较对照组(92 pg/mg)明显下降(P<0.05)。

图1 两组小鼠脑内SP形成(DAB，×200)

3 讨 论

目前认为多种机制参与了AD的病理过程，如Aβ毒性、tau蛋白异常修饰等〔5〕。Aβ的产生和代谢不平衡，长期累积会导致Aβ的沉积和SP的形成，引起神经元损伤和认知功能衰退，在这个过程中并发或单独发生NFTs，最终导致神经元变性和死亡。Aβ在AD发病过程中起到了中心和共同通道的作用，所以针对其进行治疗是防治AD发生的一个重要措施。

VPA是广泛用于治疗癫痫和双向情感障碍的药物，其安全性和耐受性测试已经通过临床测试〔6〕，但是对常见的退行性疾病的治疗还需要进一步评估其有效性。VPA可以介导小胶质细胞对Aβ的清除作用，可能是一种潜在的治疗AD的药物。VPA通过增加生长相关蛋白的表达，促进轴突生长，延长细胞的寿命以及减少肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6产生，抑制核因子(NF)-κB激活，发挥抗炎作用，对抗炎症诱导的神经细胞损伤，抑制离子通道、增强γ-氨基丁酸传递，调节GSK3活性，激活细胞外信号调节激酶。VPA减少了小鼠脑内SP的形成，抑制了Aβ沉积很可能通过抑制GSK3β进而抑制了γ-分泌酶的作用〔7〕。Liao等〔8〕研究表明，人β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的增加将导致脑内Aβ的异常增多与聚集，对AD的病理过程有显著影响。因此，抑制BACE1的表达是降低Aβ的产生及治疗AD的一个有效靶点。APP/PS1双转基因小鼠携带有突变APP和PS1基因，能够模拟AD患者脑内的一些主要的神经病理过程〔9〕，是目前研究AD较好的动物模型。通过对APP/PS1转基因小鼠的研究发现，VPA对转基因小鼠脑内Aβ的生成及SP的形成具有抑制作用，与以往的研究结果一致〔10〕，显著减少了小鼠脑内SP的形成和Aβ的分泌。本研究表明VPA减少Aβ的生成，进而抑制SP的形成。

1 Zhang LH，Wang X，Zheng ZH，etal.Altered expression and distribution of zinc transporters in APP/PS1 transgenic mouse brain〔J〕.Neurobiol Aging，2010；31(1)：74-87.

2 Saido TC.Metabolism of amyloid β peptide and pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2013；89(7)：321-39.

3 Smith IF，Hitt B，Green KN，etal.Enhanced caffeine-induced Ca2+release in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem，2005；94(6)：1711-8.

4 Qing H，He G，Ly PT，etal.Valproic acid inhibits A beta production，neuritic plaque formation，and behavioral deficits in Alzheimer′s disease mouse models〔J〕.J Exp Med，2008；205(12)：2781-9.

5 李凯军，胡江平.雌二醇对冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(2):412-3.

6 Profenno LA，Jakimovich L，Holt CJ，etal.A randomized，double-blind，placebo-controlled pilot trial of safety and tolerability of two doses of divalproex sodium in outpatients with probable Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Alzheimer Res，2005；2(5)：553-8.

7 Smith AM，Gibbons HM，Dragunow M.Valproic acid enhances microglial phagocytosis of amyloid-〔beta〕1-42〔J〕.Neuroscience，2010；169(1)：505-15.

8 Liao W，Jin G，Zhao M，etal.The effect of genistein on the content and activity of α-and β-secretase and protein kinase C in Aβ-injured hippocampal neurons〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxicol,2013;112(3)：182-5.

9 Koivisto H，Grimm MO，Rothhaar TL，etal.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenic mouse model of Alzheimer′s disease independent of brain amyloid deposition〔J〕.J Nutr Biochem,2014；25(2)：157-69.

10 Hu JP，Xie JW，Wang CY，etal.Valproate reduces tau phosphorylation via cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 signaling pathways〔J〕.Brain Res Bull,2011；85(3-4)：194-200.

〔2015-03-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

黑龙江省教育厅海外学人项目(No.1153h16)；黑龙江省教育厅研究生创新科研项目(No.YJSCX2011-298HLJ)

李凯军(1979-)，男，硕士，讲师，主要从事阿尔茨海默病研究。

胡江平(1979-)，女，讲师，博士，主要从事阿尔茨海默病研究。

R322.81

A

1005-9202(2016)20-4943-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.002