肝纤维化组织中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表达及其作用机制

马 波 陈忠诚

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)



肝纤维化组织中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表达及其作用机制

马 波 陈忠诚1

(白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000)

目的 探讨肝纤维化大鼠肝组织中抗衰老标志蛋白(RGN)及抗增殖蛋白(PHB)的表达及其作用机制。方法 48只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组(12只)、造模组(36只)。使用猪血清诱导大鼠肝纤维化，造模成功后随机分为肝纤维化组(16只)、CGII干预组(16只)。CGII干预组给予60 mg/ml CGII肌肉注射，肝纤维化组和正常对照组给予等量的等渗盐水肌肉注射，1次/d，连续6 w。取大鼠肝组织行HE和Masson染色；RT-PCR检测肝组织中RGN和PHB mRNA表达，免疫组化检测蛋白表达。结果 HE和Masson染色显示，肝纤维化组大鼠纤维化程度明显高于正常对照组；CGII干预组大鼠肝组织胶原变细、减少，纤维化程度较肝纤维化组明显改善。纤维化组大鼠肝组织中RGN和PHB蛋白表达量明显少于正常对照组(P<0.01)；CGII干预组RGN和PHB蛋白表达量明显高于纤维化组(P<0.01)。肝纤维化组RGN和PHB mRNA表达水平明显低于正常对照组(P<0.05)；CGII干预组RGN和PHB mRNA表达水平明显高于肝纤维化组(P<0.01)。结论 RGN和PHB在大鼠肝纤维化组织中表达降低，与肝纤维化存在相关性。

肝硬化；抗衰老蛋白；抗增殖蛋白

活化的肝星状细胞(HSC)产生胞外基质异常沉积是肝纤维化的病理基础。肝损伤后抗衰老标志蛋白(RGN)及其基因表达下调〔1〕；抗增殖蛋白(PHB)可能通过抗细胞增殖抑制肾小管间质纤维化〔2〕；推测二者可能与肝纤维化存在关系，但目前仍未见相关报道。本研究使用猪血清诱导肝纤维化大鼠模型，并选用抗肝纤维化药物谷胱甘肽复方注射液(CGII)进行干预，观察肝组织中RGN和PHB的表达变化。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康清洁级Wistar雄性大鼠48只，质量230～270 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号：SCXK(吉)：2011-0004。猪血清购于南京森贝伽生物科技有限公司；CGII、等渗盐水购于重庆药友制药有限责任公司；衰老标记蛋白(SMP)30、sPM311一抗，Envision两步法免疫组化试剂盒购于上海西宝生物科技有限公司。

1.2 分组与建模 48只大鼠随机分为正常对照组(12只)、造模组(36只)。造模组腹腔注射猪血清0.5 ml/只，2次/w，连续8 w；随机处死4只行病理学检查，病理改变符合大鼠肝纤维化病理诊断标准3～4级改变。正常对照组腹腔注射等渗生理盐水0.5 ml/只，2次/w，连续8 w。造模成功后将造模组剩余的32只随机分为肝纤维化组和CGII干预组，每组16只。CGII干预组大鼠肌肉注射60 mg/ml的CGII，2.7 mg/kg，1次/d；肝纤维化组和正常对照组大鼠肌肉注射等剂量的等渗盐水。每周称重1次，调整给药剂量，连续6 w。

1.3 检测指标

1.3.1 肝组织病理学检查 取三组大鼠相同部位肝组织，4%多聚甲醛溶液固定1 d，常规组织脱水，石蜡包埋后3 μm连续

切片，行苏木素-伊红(HE)和Masson染色。光学显微镜下观察肝组织病理学改变并依据Ishak方法分级。

1.3.2 肝组织RGN和PHB mRNA表达量 Trizol试剂盒提取肝组织总RNA，纯化后采用紫外分光光度法测定RNA量和纯度。取1 000 ng总RNA，逆转录合成cDNA第一链，将此作为模板行实时定量PCR，获得每个样本的起始拷贝数。以β肌动蛋白为对照，每组样本分2份，在指数期内设定参数值，得到每个PCR反应的Ct值。以标本的目的片段与带内参片段的Ct比值为该标本表达的相对值，将对照组表达量为100%，计算另外两组mRNA的相对表达量。

1.3.3 免疫组化检测 采用Elivision两步法，石蜡切片常规脱蜡水化，高压热修复抗原，滴加一抗(1∶500)，4℃孵育过夜，滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色后HE复染。光学显微镜下每张切片选取4个高倍镜视野，计数100个细胞，肝组织细胞质染成黄色或棕黄色为阳性，计算阳性细胞百分比。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 三组大鼠肝组织HE和Masson染色 正常对照组大鼠肝组织细胞以中央静脉为中心放射状排列，索条状排列的肝细胞形成肝细胞索，其间有肝血窦。肝纤维化组大鼠肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，汇管区结缔组织增生形成纤维间隔，包绕并分割正常肝组织，纤维化程度明显高于正常对照组。CGII干预组大鼠肝组织胶原变细、减少，向肝小叶延伸，纤维化程度较肝纤维化组明显改善。见图1。

2.2 三组大鼠肝组织RGN和PHB蛋白表达 正常对照组大鼠肝组织RGN主要表达于肝实质和间质细胞内，细胞核存在部分表达；PHB主要表达于细胞质、汇管区、细胞间质，少数表达于细胞核。纤维化组大鼠肝组织中RGN和PHB蛋白表达量明显少于正常对照组(P<0.01)；CGII干预组RGN和PHB蛋白表达量明显高于纤维化组(P<0.01)。见图2，表1。

图1 三组大鼠肝组织HE和Masson染色(×200)

图2 三组大鼠肝组织RGN和PHB蛋白的免疫组化染色(×400)

分组nRGNPHB正常对照组1262.19±6.8556.97±5.34肝纤维化组1611.96±3.701)15.61±3.861)CGII干预组1648.69±6.362)44.83±2.552)

与正常对照组相比：1)P<0.05；与肝纤维化组相比：2)P<0.05；下表同

2.3 三组大鼠肝组织RGN和PHB mRNA表达 肝纤维化组RGN和PHB mRNA表达水平明显低于正常对照组(P<0.05)；CGII干预组RGN和PHB mRNA表达水平明显高于肝纤维化组(P<0.01)。见表2。

表2 三组大鼠肝组织RGN和PHB mRNA相对表达量

3 讨 论

RGN为一种高保守的亲水性蛋白，主要分布于肝、肾细胞中，维持胞内钙离子平衡，在钙离子信号传导中发挥关键作用。研究发现，肝损伤、高血压会导致RGN表达下调〔3〕。在肝纤维化发病机制中，细胞因子和胞内钙离子浓度在肝组织星状细胞激活中起到重要作用，转化生长因子(TGF)β1、血小板衍生长因子(PDGF)是其中的两个关键细胞因子〔4〕。TGFβ1可激活HSC中的电压依赖性钙通道，增加胞外钙离子内流，连续性提升胞内钙离子，激活HSC，其中TGFβ1和Smad4信号分子表达，可上调ERK、PDGF表达，进一步激活HSC，其大量增殖胶原蛋白，形成肝纤维化。而RGN可与钙离子结合，抑制PKC激活，下调PDGF和TGFβ1的表达。

PHB为一种由细胞核DNA编码的高保守蛋白质，主要分布于细胞核、细胞膜、线粒体中。PHB参与衰老、凋亡、转录调节、细胞周期等多种细胞活动。研究发现肾小管间质纤维化的肾组织基因谱中PHB基因出现明显下调，推测其可能是介导肾纤维化的一个重要基因〔5〕。体外研究显示，PDB可有效抑制TGFβ1介导的成纤维细胞增殖活化和胞外基质的生成，该过程可能通过非Smads信号通路完成〔6〕。考虑到肝损伤是肝纤维化的起始因素，而肝损伤时RGN蛋白和mRNA表达减少；PHB还可通过抗细胞增殖来抑制肾小管间质纤维化，但二者与肝纤维化的关系仍鲜有报道。

CGII是根据俄罗斯抗肝纤维化药物仿制而成的药物，主要有效成分为肌酐和氧化型谷胱甘肽。CGII可有效缓解猪血清诱发的肝纤维化，提升肝组织中的还原型谷胱甘肽含量，降低过氧化物酶和基质金属蛋白酶(MMP)-13的表达，降低TGFβ1、PDGF、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白的表达〔7〕。本研究结果也显示CGII可有效改善猪血清诱发的大鼠肝纤维化程度。

本次研究重点在于比较正常肝组织、纤维化肝组织、CGII干预的纤维化肝组织中RGN和PHB蛋白的表达变化，结果显示，RGN和PHB与肝纤维化存在相关性，而其与HSC、TGFβ1等多种细胞因子在肝纤维化过程中的关系仍需进一步研究。

1 Rauscher I，Eiber M，Ganter C，etal.Evaluation of T1ρ as a potential MR biomarker for liver cirrhosis：Comparison of healthy control subjects and patients with liver cirrhosis〔J〕.Eur J Radiol，2014；83(6)：900-4.

2 Yeung LW，Guruge KS，Taniyasu S,etal.Profiles of perfluoroalkyl substances in the liver and serum of patients with liver cancer and cirrhosis in Australia〔J〕.Ecotoxicol Environ Saf，2013；96(1)：139-46.

3 Kim AY，Kim YK，Lee MW，etal.Detection of hepatocellular carcinoma in gadoxetic acid-enhanced MRI and diffusion-weighted MRI with respect to the severity of liver cirrhosis〔J〕.Acta Radiol，2012；53(8)：830-8.

4 Gu JJ，He XH，Li WT，etal.Safety and efficacy of splenic artery coil embolization for hypersplenism in liver cirrhosis〔J〕.Acta Radiol，2012；53(8)：862-7.

5 Cao H，Huang H，Xu W,etal.Fecal metabolome profiling of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma patients by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry〔J〕.Analy Chim Acta，2011；691(1/2)：68-75.

6 Terai S，Takami T，Yamamoto N，etal.Status and prospects of liver cirrhosis treatment by using bone marrow-derived cells and mesenchymal cells〔J〕.Tissue Eng Part Rev，2014；20(3)：206-10.

7 Oliveira-Junior MC，Monteiro AS，Leal-Junior ECP，etal.Low-level laser therapy ameliorates CCl4-induced liver cirrhosis in rats〔J〕.Photochem Photobiol，2013；89(1)：173-8.

〔2015-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林省教育厅课题(2015ZCY214)

马 波(1972-)，女，副教授，主要从事内科学研究。

R57

A

1005-9202(2016)20-4978-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.016

1 白城市医院