高脂状态下Exendin-4对胰岛βTc6细胞内胰-十二指肠同源盒-1表达、细胞增殖功能及胰岛素分泌能力的干预作用

黄林晶 侯毅翰 杨立勇 严孙杰 沈喜妹

(福建医科大学附属第一医院内分泌科 福建医科大学代谢病研究所，福建 福州 350005)



高脂状态下Exendin-4对胰岛βTc6细胞内胰-十二指肠同源盒-1表达、细胞增殖功能及胰岛素分泌能力的干预作用

黄林晶 侯毅翰 杨立勇 严孙杰 沈喜妹

(福建医科大学附属第一医院内分泌科 福建医科大学代谢病研究所，福建 福州 350005)

目的 探讨Exendin-4在高脂状态下是否具有抗脂毒性及其相关机制是否涉及胰-十二指肠同源盒(PDX)-1。方法 不同浓度的Exendin-4培育βTc6细胞不同时间，再应用1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)干预24 h，检测细胞内PDX-1表达及增殖能力和胰岛素分泌功能。结果 ①Exendin-4干预6 h，各组细胞PDX-1表达、细胞增殖能力和胰岛素分泌功能均未见明显改善;②当Exendin-4干预延长至12～24 h，随着干预浓度增高，细胞内PDX-1逐渐升高，细胞增殖能力和胰岛素分泌功能明显好转。结论 高脂状态下适宜浓度的Exendin-4干预一定时限可上调β细胞内PDX-1的表达，并改善细胞增殖功能及胰岛素分泌能力。

Exendin-4；胰-十二指肠同源盒-1；胰岛素；游离脂肪酸；βTc6细胞

肥胖，尤其是中心型肥胖与2型糖尿病(T2DM)密切相关。大量证据表明血游离脂肪酸(FFA)是T2DM发病重要的危险因素〔1〕。Exendin-4是长效的胰升血糖素样肽(GLP)-1受体激动剂，而胰-十二指肠同源盒(PDX)-1是胰腺发生与发育相关的关键转录因子之一，其在调节胰腺的发育、分化及胰岛素分泌中起着至关的重要作用〔2〕。本研究对高脂状态下的βTc6细胞进行不同浓度和不同时限的Exendin-4干预，并观察细胞内PDX-1、增殖能力和的胰岛素分泌表达情况，旨在探讨Exendin-4在高脂状态下是否能保护胰岛β细胞及其抗脂毒性作用的相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 βTc6细胞购自美国，通过DMEM培养基培养，接种于6孔板中培养，实验分组为空白对照组(NC组)、1.0 mmol/L FFA干预组(1 mmol/L组)、5 nmol/L Exendin-4 +FFA干预组(5 nmol/L组)、10 nmol/L Exendin-4+FFA干预组(10 nmol/L组)、50 nmol/L Exendin-4+FFA干预组(50 nmol/L组)。各组分别加入含有不同浓度的Exendin-4或不含Exendin-4的DMEM培养基培育不同时间(6、12、24 h)，再加入1.0 mmol/L FFA继续培养24 h。

1.2 MTT细胞活力分析 收集数生长期的βTc6细胞，计数按5×103/孔接种于96孔板中，培养使其贴壁。加入FFA、Exendin-4等各种实验因素作用后，每孔加入5 g/L四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液孵育4 h，吸走培养液，每孔加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，置于摇床上低速振荡约10 min，振摇10 min，使结晶溶解后用酶标仪于490 nm波长处测量吸光值(OD值)。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-干预组OD值)/对照组OD值。

1.3 放射免疫法检测胰岛素 将βTc6细胞制成4×105/ml 单细胞悬液，接种于6孔板，加入FFA、Exendin-4等各种实验因素作用后，通过用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培育60 min，收集上清液，按照胰岛素放射免疫分析试剂盒说明书测定其浓度。

1.4 RT-PCR检测PDX-1 mRNA表达 按照Trizol试剂盒说明进行细胞mRNA总提取，在TaqDNA聚合酶催化下行聚合酶链反应。PDX-1扩增片段长度317 bp：上游：5'CAAGATTGTGCGGTGACCT3'，下游：5'CGGCTATACCCAACTGGCT3'；β-肌动蛋白(β-actin)扩增片段长度462 bp；按照2-△△Ct计算各组PDX-1相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 高脂状态下Exendin-4干预对βTc6细胞PDX-1 mRNA表达的影响 不同浓度的Exendin-4作用βTc6细胞6 h后，再予FFA 1 mmol/L干预24 h，细胞内PDX-1 mRNA表达与1 mmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)，各浓度组表达量均明显低于NC组(P<0.05)。当Exendin-4作用时间延长至12 h，5 nmol/L组PDX-1 mRNA表达量与1 mmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)；干预浓度为10 nmol/L时PDX-1 mRNA表达较5 nmol/L组增加(P<0.05)；当浓度进一步升到50 nmol/L时，PDX-1 mRNA表达量继续上升(P<0.05)，但与NC组相比仍较低(P<0.05)。干预24 h，5 nmol/L组PDX-1 mRNA表达与1 mmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)；10 nmol/L组PDX-1 mRNA的表达量较5 nmol/L组升高(P<0.05)，但50 nmol/L组PDX-1 mRNA的表达未较10 nmol/L组进一步升高(P>0.05)，这两组表达量均低于NC组(P<0.05)。见图1。

2.2 高脂状态下Exendin-4干预对βTc6细胞增殖活性的影响 当Exendin-4干预时间设定为6或12 h，5 nmol/L组βTc6细胞的增殖能力明显下降，与1 mmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)；10 nmol/L组细胞增殖活性较前改善，与1 mmol/L组相比OD值明显改善(P<0.05)；50 nmol/L组OD值未较10 nmol/L组进一步升高。当Exendin-4干预时间增加到24 h，5 nmol/L组βTc6细胞的增殖活性较1 mmol/L组有所恢复(P<0.05)；10 nmol/L组和50 nmol/L组βTc6细胞的增殖活性明显改善，两组OD值均较5 nmol/L组进一步升高(P<0.05)。在脂毒性状态下，当Exendin-4干预浓度固定时，在6、12 h干预组中βTc6细胞的增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)，但在24 h干预组其细胞增殖活性明显较前两组改善(P<0.05)，见表1。

1～5分别为：NC，1 mmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，50 nmol/L组图1 Exendin-4干预12、24 h βTc6细胞PDX-1 mRNA的表达

分组6h12h24hNC组1.33±0.171.31±0.151.29±0.111mmol/L组0.35±0.031)0.36±0.041)0.34±0.051)5nmol/L组0.43±0.051)0.46±0.041)0.57±0.051)2)4)5)10nmol/L组0.75±0.061)2)3)0.75±0.131)2)3)0.94±0.101)2)3)4)5)50nmol/L组0.72±0.081)2)3)0.76±0.151)2)3)1.01±0.101)2)3)4)5)

与NC组相比:1)P<0.05；与1 mmol/L组相比:2)P<0.05；与5 nmol/L组相比:3)P<0.05;与6 h组相比:4)P<0.05；与12 h组相比:5)P<0.05;下表同

2.3 高脂状态下Exendin-4干预对βTc6细胞胰岛素分泌功能的影响 当Exendin-4干预时间设定为6或12 h，5 nmol/L干预组βTc6细胞的胰岛素分泌(GSIS)与1 mmol/L组无明显差异(P>0.05)；10 nmol/L组的GSIS有所恢复，其虽然低于对照组(P<0.05)，但较1 mmol/L组明显改善(P<0.05)；50 nmol/L组的GSIS未较10 nmol/L组进一步升高(P>0.05)。当干预时间设定为24 h，5 nmol/L组的GSIS高于1 mmol/L组(P<0.05)，而10、50 nmol/L组的GSIS较5 nmol/L组明显改善(P<0.05)。当Exendin-4干预浓度稳定时，随着干预时限的延长，细胞内GSIS逐渐改善。另经析因设计的方差分析表明，在高脂状态下，随着Exendin-4干预时限的延长及干预浓度的增加，βTc6细胞内GSIS得到更加明显改善，见表2。

表2 高脂状态下Exendin-4干预βTc6细胞的GSIS功能改变

3 讨 论

长期高FFA血症可导致胰岛β细胞脂质过载，诱导细胞凋亡和坏死，从而使胰岛β细胞数目减少；也可使胰岛β细胞分泌功能损伤，胰岛素分泌减少〔3〕。既往研究表明，1 mmol/L FFA干预24 h对胰岛βTc6细胞的功能产生明显的抑制作用，细胞呈现出明显的凋亡趋势，细胞增殖能力和胰岛功能均受到明显抑制，细胞内转录因子PDX-1表达明显减少〔4，5〕。

本研究发现，高脂状态下βTc6细胞PDX-1 mRNA的表达、细胞增殖能力及胰岛分泌功能与Exendin-4存在明显的浓度及时间依赖性。不同浓度Exendin-4干预6 h不能有效拮抗高浓度FFA对细胞的脂毒性作用，且PDX-1基因表达未见好转，但10、50 nmol/L Exendin-4干预组内的细胞增殖能力和胰岛素分泌功能已较1 mmol/L高FFA组有一定程度提高，表明细胞增殖能力和胰岛分泌功能有所改善。这种PDX-1细胞转录因子的基因表达并未改善但β细胞相关功能却出现适当的恢复，考虑与Exendin-4干预时间较短不能激活PDX-1及其相关调控基因表达有关，但可能通过调控其他信号转导途径使β细胞的功能微弱改善〔6〕。但当干预时间延长至12～24 h，βTc6细胞PDX-1 基因表达明显改善，其增殖能力和胰岛素分泌功能也得到明显修复。本研究也显示低浓度Exendin-4干预12 h虽然PDX-1基因表达改善，但细胞增殖活性和分泌功能并未出现好转，考虑PDX-1作为胰岛β细胞内重要的转录调控因子，其发挥生物学效应须转位至细胞核内，虽然PDX-1表达改善，但胰岛β细胞内仍有大量脂质堆积，神经酰胺合成增加，致使另一个转录因子探讨叉头状转录因子(Fox)01与其竞争转位，从而使PDX-1转位至细胞核内受限无法完全发挥其生物学效应有关〔7〕。本研究也发现了50 nmol/L Exendin-4干预24 h PDX-1表达和胰岛细胞相关功能并未比10 nmol/L组得到改善，考虑可能与β细胞膜表面的GLP-1受体饱和性有关〔8〕。

Exendin-4在β细胞中发挥生物学效应与PDX-1密切相关。研究显示，Exendin-4要发挥其生物学效应必须与细胞膜上GLP-1受体相结合，而PDX-1是其发挥生物学作用所必需的重要转录因子〔9〕。Wang等〔10〕认为Exendin-4与GLP-1受体结合后通过cAMP/PKA这条信号转导通路上调β细胞内PDX-1的表达与核定位，从而发挥其生物学功能，并且腺苷酸环化酶激活剂Forskolin及8-溴-cAMP可以模拟GLP-1对PDX-1的正性作用〔11〕。

1 Slagter SN,van Vliet-Ostaptchouk JV,van Beek AP,etal.Health-related quality of life in relation to obesity grade,type 2 diabetes,metabolic syndrome and inflammation〔J〕.PLoS One,2015;10(10):e0140599.

2 Hwang SL,Kwon O,Kim SG,etal.B-cell translocation gene 2 positively regulates GLP-1-stimulated insulin secretion via induction of PDX-1 in pancreatic β-cells〔J〕.Exp Mol Med,2013;45:e25.

3 Giacca A,Xiao C,Oprescu AI,etal.Lipid-induced pancreatic beta cell dysfunction:focus on in vivo studies〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2011;300:E255-62.

4 杨立勇,侯毅翰，沈喜妹,等.游离脂肪酸对βTc6细胞PDX-1表达及胰岛素分泌能力的影响〔J〕.国际内分泌代谢杂志,2009;29(6)：381-4.

5 黄林晶，杨立勇，严孙杰，等.Exendin-4对游离脂肪酸介导的βTc6细胞GK和GLUT2表达改变的干预作用〔J〕.中国糖尿病杂志,2013;21(9)：832-5.

6 Tews D,Lehr S,Hartwig S,etal.Anti-apoptotic action of exendin-4 in INS-1 beta cells:comparative protein pattern analysis of isolated mitochondria〔J〕.Horm Metab Res,2009;41(4):294-301.

7 Poitout V,Hagman D,Stein R,etal.Regulation of the insulin gene by glucose and fatty acids〔J〕.J Nutr,2006;136(4):873-6.

8 Kim MJ,Kang JH,Park YG,etal.Exendin-4 induction of cyclin D1 expression in INS-1 β-cells:involvement of cAMP-responsive element〔J〕.J Endocrinol,2006;188:623-33.

9 Li Y,Cao X,Li LX,etal.β-Cell Pdx1 expression is essential for the glucoregulatory,proliferative,and cytoprotective actions of glucagon-like peptide-1〔J〕.Diabetes,2005;54(2):482-91.

10 Wang X,Zhou J,Doyle ME,etal.Glucagon-like peptide-1 causes pancreatic duodenal homeobox-1 protein translocation from the cytoplasm to the nucleus of pancreatic beta-cells by a cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A-dependent mechanism〔J〕.Endocrinology,2001;142(5):1820-7.

11 Kwon G,Pappan KL,Marshall CA,etal.cAMP dose-dependently prevents palmitate-induced apoptosis by both protein kinase A-and cAMP-Guanine nucleotide exchange factor-dependent pathways in β-cells〔J〕.J Biol Chem,2004;279(10):8938-45.

〔2015-02-19修回〕

(编辑 苑云杰)

国家自然科学基金(81500632)；福建省青年科研基金(2015-1-48)

杨立勇(1957-)，男，博士生导师，教授，主任医师，主要从事糖尿病研究。

黄林晶(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事糖尿病研究。

R341.6；R977.6

A

1005-9202(2016)20-4945-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.003