香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响

屈宝泽 游 陆 刘奇峰

(辽宁医学院附属第一医院心内科，辽宁 锦州 121001)



香烟烟雾提取物对大鼠主动脉平滑肌细胞迁移的影响

屈宝泽 游 陆 刘奇峰

(辽宁医学院附属第一医院心内科，辽宁 锦州 121001)

目的 探讨香烟烟雾提取物(CSE) 对大鼠A10主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)迁移的影响及可能机制。方法 体外培养大鼠VSMC，并分为空白对照组及CSE组，其中CSE组给予5%CSE处理24 h，应用Transwell方法检测两组VSMC的迁移能力；应用RT-PCR 和 Western 印迹方法检测两组骨桥蛋白(OPN)表达水平。结果 CSE组VSMC迁移能力较空白对照组明显增强；同时CSE组OPN mRNA及蛋白表达均较空白对照组明显升高(P<0.01)。结论 CSE能够促进大鼠VSMC的迁移，其机制可能与上调OPN表达有关。

香烟烟雾提取物；血管平滑肌细胞；迁移；骨桥蛋白

血管重塑是高血压、冠脉介入治疗术后再狭窄及动脉硬化等血管相关疾病的共同病理生理过程之一，而血管平滑肌细胞(VSMC)向内膜下增殖与迁移是血管重塑的重要病理基础〔1～3〕。吸烟是动脉粥样硬化、高血压等多种血管相关疾病的重要危险因素之一，参与了血管重塑的发生发展过程，但其机制尚有待研究。骨桥蛋白(OPN)是一种分泌型的糖基化磷蛋白，应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖。本研究拟应用香烟烟雾提取物(CSE)对大鼠 VSMC进行处理，观察其对大鼠 VSMC 迁移的影响，并检测OPN表达水平的变化，对CSE参与血管重塑的机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 材料 本实验所需香烟(美国肯塔基大学烟草健康研究所烟草研究用香烟 3R4F)；胎牛血清(杭州四季青公司)；大鼠A10主动脉VSMC株(美国ATCC细胞库)、RT-PCR逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；OPN、α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗体(Santa Cruz)；Transwell试剂盒(Corning)。

1.2 细胞培养 VSMC采用DMEM培养基培养(含10%的胎牛血清)，细胞在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养。每2～3天换液一次。待细胞汇合度达到80%～90%时，予以传代。

1.3 细胞分组及方法 培养的VSMC分为2组：①空白对照组；②CSE组 (终浓度为5%CSE刺激24 h)。Transwell 法检测VSMC的迁移能力。应用0.25%的胰酶消化细胞，应用10%胎牛血清无抗生素DMEM终止消化，离心800 r/min，5 min，弃上清，无血清无抗生素DMEM 1 ml重悬细胞(5×105/ml)。将含10%胎牛血清的 DMEM 600 μl加入到Transwell下室中，并将上室置于下室中，同时吸取100 μl的细胞悬液加入到上室。在条件为37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中连续孵育24 h后，取出上室，用沾有PBS液的棉签将上室中的细胞擦掉，用4℃下预冷后的95%酒精将迁移至小室滤膜外表面的细胞固定30 min后，再用苏木素染剂染色15 min，置于1%的盐酸酒精下分化3 s。用自来水冲洗15 min。过夜晾干上室滤膜，用刀片将其切下，滴加半滴中性树胶于载玻片上，将下室面朝上并平铺于载玻片上，再将半滴中性树胶滴加到膜上，最后用盖玻片将封片保存。于光学显微镜下照相，并计数迁移到下室面滤膜的VSMC，计数5个HP视野(×200)的穿膜细胞数，取平均数，计算VSMC迁移抑制率。

1.4 RT-PCR法检测OPN mRNA的表达 94 ℃ 5 min ；93 ℃ 变性30 s，OPN 54 ℃ ，GAPDH 56℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共 30 个循环，最后72℃延伸10 min。扩增结束后取 5 μl PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析(120 V，45 min)，DNAgreen染色，凝胶自动成像分析系统扫描成像，以GAPDH为内参。OPN上游引物5′-GCTGAAGCCTGACCCATCT-3′ ，下游引物5′-TCCCGTTGCTGTCCTGAT-3′； GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5 Western 印迹检测OPN蛋白表达 加入RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；1 mmol/L PMSF，0.1 mmol/L，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，NaVO4，10 mg/ml aprotinin，10 mg/ml LeuPePtin)200 μl裂解细胞，将蛋白浓度调至5 μg/μl。以每孔50 μg 的含量加样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳分离。转膜于PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入1∶500稀释的OPN兔抗大鼠多克隆抗体，α-tubulin兔抗大鼠多克隆抗体4℃孵育过夜。TTBS洗膜 5 min×3，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TTBS洗膜5 min×2，TBS洗膜5 min×1，加DAB液显色5～10 min。凝胶成像分析系统成像。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行LSD方法。

2 结 果

2.1 CSE对VSMC迁移的影响 与空白对照组相比，CSE组VSMC的迁移能力明显增强(P< 0.01)。见图1。

图1 CSE对VSMC迁移的影响(×200)

2.2 CSE对VSMC中OPN mRNA表达的影响 CSE组OPN mRNA的表达较空白对照组明显升高(P< 0.01)。见图2。

图2 OPN mRNA表达水平

2.3 CSE对VSMC中OPN蛋白表达的影响 与空白对照组比较，CSE组OPN蛋白的表达明显升高(P< 0.01)。见图3。

图3 OPN 蛋白表达水平

3 讨 论

随着竞争压力的不断增加和饮食生活习惯的改变，高血压、动脉粥样硬化、血管支架术后再狭窄等血管相关疾病已经愈来愈严重地威胁着人类的健康。血管相关疾病受多种危险因素的相互影响，其中包括年龄、性别、遗传因素、糖尿病、脂代谢紊乱、吸烟等，其中吸烟被公认为是此类疾病的主要危险因素〔4,5〕。近年来，吸烟与血管相关疾病的相关性研究已经越来越引起人们的重视，但其相关机制仍未完全明确。

血管重塑是血管相关疾病的共同病理生理过程。血管重塑是指血管壁在局部生长因子、血管活性物质及血流动力学等的共同作用下，管壁结构发生改变的主动过程，其主要特征是内皮细胞功能紊乱、VSMC的增殖和迁移以及细胞外基质(ECM)的沉积。其中，血管中膜平滑肌细胞向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理基础之一。

随着对吸烟与血管相关机制研究的深入，人们发现吸烟可促进VSMC增殖。有学者报道其可能与吸烟引起血管活性因子如结缔组织生长因子、内皮素、血管内皮生长因子等的大量释放有关〔6～8〕，其机制可能与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)等信号传导通路有关〔9〕。但目前国内外关于吸烟对VSMC迁移影响的相关研究尚少见。本研

究表明CSE能够显著促进VSMC的迁移，并进而介导血管重塑。根据功能和结构的不同，将VSMC分为收缩型和合成型，生理状态下的VSMC呈收缩表型。而VSMC增殖、迁移的必要条件为VSMC由收缩表型转换为合成表型。OPN是一种重要的细胞外基质蛋白，参与了骨代谢、炎症、肿瘤生长及免疫代谢等多种生命现象〔10～12〕。近年来，研究发现血管受损后其新生内膜中的OPN表达水平显著上调〔13〕。因此，OPN被认为是血管重塑过程中重要的始动因素。本实验表明CSE可通过上调OPN表达从而促进VSMC的迁移。

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8 耿 雷,刘闺男.烟草烟雾刺激通过骨桥蛋白对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响〔J〕.中国现代医生,2010；48(8):7-9.

9 胡 静,徐永健,张珍祥，等.香烟烟雾提取物通过PKC途径促进大鼠肺动脉平滑肌细胞bFGF表达〔J〕.中国病理生理杂志,2008；24(6):1228-30.

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12 Iwadate H,Kobayashi H,Kanno T,etal.Plasma osteopontin is correlated with bone resorption markers in rheumatoid arthritis patients〔J〕.Int J Rheumat Dis，2014；17(1):50-6.

13 KatoR,Momlyama Y,Ohlllori R,etal.Prognostic significance of plasma osteopontin levels in patients under going percutaneous coronary intervention〔J〕.Circulation,2009；73(1):152-7.

〔2015-04-15修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

辽宁医学院附属第一医院科技启动基金项目(FYK201207)

刘奇峰(1980-)，女，主治医师，博士，主要从事冠心病的病理生理基础研究。

屈宝泽(1971-)，男，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病的临床防治研究。

R543.12

A

1005-9202(2016)20-4971-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.013