上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭、增殖能力的影响

王文革 李军强 石 菲 李洪涛

1.兰州军区临潼疗养院附属医院普外科，陕西西安710600；2.兰州军区总院普外科，甘肃兰州730050

上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭、增殖能力的影响

王文革1李军强1石 菲1李洪涛2

1.兰州军区临潼疗养院附属医院普外科，陕西西安710600；2.兰州军区总院普外科，甘肃兰州730050

目的探索上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭、增殖水平的影响。方法构建Sema3A正义表达载体，慢病毒包装后感染人结肠癌SW620细胞，获取稳定过表达的Sema3A结肠癌细胞株。实验同时设置空白对照组、阴性对照组。行Transwe11、MTT、克隆形成实验探索过表达Sema3A对SW620生物学行为的影响。结果成功构建过表达Sema3A的人结肠癌SW620细胞株。与阴性对照组比较，Sema3A过表达细胞株的增殖速度减慢，克隆形成率下降，侵袭能力降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。结论外源性上调Sema3A表达水平可降低SW620体外增殖、侵袭转移能力，提示Sema3A对结肠癌生长、侵袭存在抑制作用。

Sema3A；结肠癌；增殖；侵袭

结肠癌（Co1orecta1 cancer，CRC）为最常见的消化道癌症之一，发病率高居恶性肿瘤的第三位。西方国家结肠癌死亡率高居癌症类疾病前三位［1］。随着饮食结构变化，近年我国CRC发病和死亡人数逐年递增［2］。从良性腺瘤或囊肿发展到晚期结肠癌、转移瘤，包含了基因、蛋白质水平的多重改变［3］。臂板蛋白3A抗体（Semaphorin3A，Sema3A）是导向蛋白Semaphorin家族中的重要分子之一［4］，其有拆解细胞骨架、纤丝状肌动蛋白等功能［5-6］。随着研究的深入，发现Sema3A除了可以促进神经元生长、再生，还能调节肿瘤细胞的生长、增殖水平［7］。在多种癌症组织或细胞中，Sema3A均有不同程度的表达下调或缺失，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭、转移［8］。本研究旨在观察Sema3A在结肠癌细胞侵袭、增殖中的作用，探索过表达Sema3A对结肠癌细胞的生物学行为的影响，揭示其抑制结肠癌增殖、侵袭的作用机制，为临床研究提供相应试验依据。

1 对象与方法

1.1 仪器与试剂

人结肠癌细胞株SW620引自中科院上海细胞库。慢病毒病毒载体（Lentivirus-Sema3A）、阴性对照载体（CON145）以及慢病毒包装试剂盒（上海吉凯基因化学技术有限公司）。四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），胰酶（上海化学试剂有限公司试剂一厂），荧光显微镜（日本O1ympus），CO2孵箱（日本Sanyo），生物安全柜（上海振梓创空气净化设备有限公司），RPMI 1640培养液（美国Gibco），Trizo1（美国Invitrogen），PCR引物、反转录试剂盒以及SYBR Green Rea1-time PCR Masker Mix试剂盒（日本TaKaRa），MTT（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），E1x800酶标仪（美国BioTek），Giemsa染液ECM550（美国Chemicon），多聚甲醛［生工生物工程（上海）股份有限公司］，RnaseA ENO531（加拿大Fermentas），Transwe11小室（美国Corning），酶标仪（美国Thermo）。其余试剂为本实验保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养于37℃、5%CO2、饱和湿度条件，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养SW620，实验细胞取对数生长周期细胞。

1.2.2 慢病毒载体构建上海吉凯基因化学技术有限公司构建过表达Sema3A慢病毒载体（Lentivirus-Sema3A），其表达绿色荧光蛋白（GFP）。胰酶消化SW620细胞后配制成细胞悬液，以数量约为5×105的细胞悬液接种于6孔细胞培养板中，放置孵箱中待细胞融合度达30%，以细胞感染复数（MOI）值（MOI为20）加入相应量慢病毒。设置空白对照组（CON组）、阴性对照组（N1组，仅有GFP）、过表达Sema3A慢病毒细胞组（SE，携带Sema3A+GFP）。转染16 h后换液。转染72 h荧光拍照，以GFP观察感染率，若荧光率＞80%收集细胞，提取RNA以进行Rea1-time PCR试验。

1.2.3 Real-time PCR试验用Trizo1等有机溶剂提取总RNA，进行RNA含量和质量检验后，选择纯度较高的RNA用于后续实验。首先将总RNA反转录为cDNA：37℃，15 min，反转录反应；85℃，5 s，反转录酶的失活反应。之后进行Rea1-time PCR试验：95℃，5 s变性60℃，30 s退火延伸；共30个循环。以β-actin作为内参基因，Sema3A和β-actin引物序列由Takara公司设计合成。

1.2.4 SW620细胞转染后生长曲线转染96 h后胰酶消化细胞（CON、N1、SE），重悬行细胞计数后以2000 ce11s/we11转种96孔板继续培养，设1、2、3、4、5 d共5个检测时间点，每个时间点设复孔5个。采用胎牛血清+无抗生素RPMI 1640培养液培养至相应检测点，行MTT实验测细胞悬液吸光度值（490 nm）。以上实验重复3次。

1.2.5 克隆形成实验转染4 d胰酶消化N1、SE组细胞，重悬行细胞计数后接种6孔培养板（800 ce11s/we11），加含10%DFBS的MEM培养液2 mL/we11，设复孔3个/组，培养7 d。换液、观察细胞1次/3 d，荧光显微镜下拍照。PBS洗涤，加入多聚甲醛1 mL/we11固定1 h，磷酸盐缓冲液洗涤细胞，Giemsa染色20 min，ddH2O洗涤后显微镜下观察克隆形成情况，并拍照计数。

1.2.6 Transwell侵袭实验转染24 h后用胰酶处理N1、SE组，接种细胞于预包备Matrige1胶的Transwe11上室（其孔径为8 μm）。分别加RPMI 1640培养液（1%胎牛血清）于上室以及含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于下室，培养24 h。拭去Transwe11孔径膜上细胞，用4%多聚甲醛固定膜下细胞，然后结晶紫染色细胞。荧光显微镜（100×）下观察侵袭情况，并随机选5个镜下视野（100×）行细胞计数及拍照（200×）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sema3A表达载体的构建

Lentivirus-Sema3A慢病毒转染72 h后于显微镜下观察结肠癌细胞SW620，转染效率约为80%，见图1（封三）。采用Rea1 time-PCR检测SE组SW620细胞中Sema3A mRNA水平高于N1组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。提示包装Sema3A载体的慢病毒有效上调人结肠癌细胞SW620的Sema3A表达水平。

2.2 Sema3A过表达对SW620细胞生长、增殖能力的影响

MTT实验显示，转染3、4、5 d时，病毒转染的SE组的SW620细胞数目较CON组及N1组明显减少，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；CON组细胞数目与N1组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示上调Sema3A表达后，人结肠癌细胞SW620增殖速度较前减慢。见图3。

克隆形成实验显示，SE组的SW620细胞的克隆形成能力较N1组差，N1组克隆数为（273±6）个，SE组克隆数为（168±4）个，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01），见图4。该结果与MTT结果一致，提示上调Sema3A表达后人结肠癌细胞SW620的生长、增殖受到抑制。

2.3 Sema3A过表达对SW620细胞侵袭能力的影响

细胞侵袭实验提示，SE组SW620细胞的穿膜细胞数目较N1组减少，SE组细胞侵袭力为2.437± 0.123，N1组细胞侵袭力为5.231±0.231，两组比较差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图5（封三）。

3 讨论

作为轴突导向因子家族，Semaphorins起初的研究多集中于神经系统。随着研究深入，发现该分子在肿瘤生长增殖、血管内皮细胞迁移、免疫反应均有重要作用。Semaphorins通过促进或抑制血管生长而调节肿瘤发生发展。Semaphorins家族受体主要为Neuropi1ins以及P1exins，前者为Semaphorins蛋白结合位点，后者起到信号转换功能［9］。Sema3A为NP-1激动剂，P1exin A为其中的信号转换亚单元［10］。研究Sema3A激活的细胞靶点、受体结合位点，发现其具有提升趋药性、引力、轴突/树突生长发育等作用［11］。Tamagnone等［12］发现，Sema3A作用范围不仅包括引导细胞移行、调控免疫功能，还调节血管生成、肿瘤增殖。Bagci等［13］的研究发现Sema3A通过调控底物黏附力而促进胶质母细胞瘤的播散［13］。在2011年，B1anc等［14］的研究提示Semaphorins及其受体（p1exins及neuropi1ins）在前列腺癌组织中广泛表达，且Sema3A在肿瘤组织中表达水平较正常组织高（P＜0.05）。同年，Staton等［15］研究提示：Sema3A低表达与乳腺导管癌的侵袭力密切相关。

大量研究提示Sema3A在肿瘤增殖中有抑制侵袭、转移的作用［16］，故本研究构建Sema3A过表达载体，探索其是否影响结肠癌增殖、侵袭、转移水平［17］。通过慢病毒载体转染至人结肠癌细胞SW620中，设上调Sema3A表达组、空白对照组、阴性对照组，检测并比较三组细胞中生长曲线、增殖、细胞侵袭力。实验结果提示，Sema3A过表达载体成功构建：SE组Sema3A水平较N1组、CON组明显升高；上调Sema3A表达水平后，SW620细胞生长、增殖、侵袭水平均较空白对照明显下降。提示Sema3A极有可能通过下调结肠癌细胞的生长水平、增殖能力、侵袭力来抑制肿瘤增殖、转移能力。高表达Sema3A与抑制结肠癌增殖、侵袭力密切相关，可纳入肿瘤标志物候选项目。进一步探索Sema3A对结肠癌细胞作用的特异性受体及其下游信号分子可全面研究Sema3A抑制人结肠癌增殖、侵袭力的关键信号通路，为结肠癌临床筛查、治疗手段开辟新道路。

图2 Real time-PCR检测转染后人结肠癌细胞SW620的Sema3A在RNA水平的表达

图3 病毒转染后SW620细胞生长曲线

图4 病毒转染后SW620细胞克隆形成数

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Effect of uP-regulating Sema3A on Proliferation and invasion of colorectal cancer cells

WANG Wenge1LI Junqiang1SHI Fei1LI Hongtao2
1.Department of Genera1 Surgery，the Affi1iated Hospita1 of Lintong Sanitarium of Mi1itary Area Command of Lanzhou，Shaanxi Province，Xi'an710600，China；2.Department of Genera1 Surgery，Genera1 Hospita1 of Mi1itary Area Command of Lanzhou，Gansu Province，Lanzhou730050，China

Objective To study the effect of up-regu1ating Sema3A on pro1iferation and invasion of co1orecta1 cancer ce11s.Methods The Sema3A sense expression vector was constructed.Then the SW620 ce11s of co1orecta1 cancer were infected using the 1enti-virus packaging to obtain the stab1e co1orecta1 cancer ce11 1ines with over-expressing of Sema3A.Whi1e the b1ank contro1 group and negative contro1 group were set up in this experiments.Transwe11 assays，MTT，and c1one formation assays were used to observe the effect of over-expression of Sema3A on the bio1ogica1 behavior of human co1orecta1 cancer ce11s SW620.Results Lenti-virus vector with over-expressing of Sema3A was successfu11y constructed.Compared with the negative contro1 group，over-expression of Sema3A reduced the pro1iferation，dec1ined the c1one formation rate and decreased the invasion of SW620 ce11s of co1orecta1 cancer，the differences were statistica11y significant（P＜0.01）.Conclusion Exogenous over-expression of Sema3A can decrease the metastasis abi1-ity of co1orecta1 cancer ce11s and inhibite their abi1ity of pro1iferation which suggests that Sema3A may p1ay an important ro1e in co1orecta1 cancer progression.

Sema3A；Co1orecta1 cancer；Pro1iferation；Invasion

R735.3

A

1673-7210（2016）07（c）-0013-04

2016-04-03本文编辑：任念）

国家自然科学基金青年基金资助项目（8130 1681）。

王文革（1966-），男，副主任医师；研究方向：普外科。

李洪涛（1976.5-），男，副主任医师；研究方向：胃肠疾病。