黑水缬草提取物对阿尔茨海默病模型小鼠治疗作用的代谢组学研究

王 喆 李 伟 李菁媛 李 琳 李乃静

1.中国医科大学附属盛京医院干诊科，辽宁沈阳110016；2.沈阳药科大学药物分析教研室，辽宁沈阳110016

黑水缬草提取物对阿尔茨海默病模型小鼠治疗作用的代谢组学研究

王 喆1李 伟2李菁媛1李 琳1李乃静1

1.中国医科大学附属盛京医院干诊科，辽宁沈阳110016；2.沈阳药科大学药物分析教研室，辽宁沈阳110016

目的运用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）探讨黑水缬草提取物对阿尔茨海默病（AD）的治疗机制。方法将雄性昆明小鼠分为3组，分别为对照组（2%吐温80）、AD模型组（2%吐温80）和治疗组（95%黑水缬草粗提物2 g/kg），灌胃给药30 d。运用Morris水迷宫实验和UPLC-MS技术对小鼠进行研究。结果Morris水迷宫定位航行实验显示，与对照组比较，AD模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.05），治疗组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）。空间探索实验显示，与对照组比较，AD模型组小鼠单位时间目标象限停留时间短，穿台次数减少（P＜0.05），治疗组小鼠单位时间内目标象限停留时间长，穿台次数增加（P＜0.05）。通过UPLC-MS/MS技术，确定了10种AD的血浆生物标志物，分别为组氨酸、溶血磷脂酰胆碱C16∶0、溶血磷脂酰胆碱C18∶2、溶血磷脂酰胆碱C18∶1、溶血磷脂酰胆碱C20∶4、溶血磷脂酰胆碱C22∶6、十六碳鞘磷脂、二氢神经鞘氨醇、4-羟双氢（神经）鞘氨醇C18、4-羟双氢（神经）鞘氨醇C20，与对照组比较，AD模型组小鼠血浆中10种标志物的含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。治疗组小鼠血浆中10种标志物的含量均明显上升（P＜0.05或P＜0.01）。结论黑水缬草提取物可提高AD小鼠的认知功能，其作用机制与氨基酸、磷脂和鞘脂代谢等相关代谢通路有关。

阿尔茨海默病；黑水缬草；代谢组学；生物标志物

阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的中枢神经系统受损性疾病，是最常见的痴呆类型［1］。随着人口老龄化，AD已成为致老年人死亡的第四大疾病［2］。黑水缬草（Valeriana amurensis）为败酱科缬草属植物，具有镇静、抗抑郁及抗心血管疾病等作用［3］，有研究表明黑水缬草具有治疗AD的功效［4］。本研究运用代谢组学技术研究黑水缬草提取物对AD的调控机制，为AD的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

黑水缬草由安国市瑞泰堂药材行提供；Aβ25～35由美国Sigma公司生产；色谱乙腈、色谱甲醇，购于美国J.T.Baker公司；TGL-16台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机有限公司，离心腔直径250 mm）；仪器为液相系统Waters AcquityTMU1tra Performance Liquid Chromatography（UPLC）System，质谱仪Micromass Quattro microTMAPI三重四级杆质谱仪，美国Waters公司。

1.2 实验动物

12周雄性KM小鼠24只，体重18～22 g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，动物合格证号［SCXK（辽）2010-0001］。置于室温（25±2）℃，12/12 h昼夜循环光照条件下生活，自由摄食、饮水。

1.3 黑水缬草提取物制备

将500 g干燥的黑水缬草根及根茎粉碎成粗粉，以10倍体积的95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，滤过，回收乙醇液，减压浓缩，得150 g乙醇提取物，即黑水缬草95%粗提物。

1.4 AD模型制备

实验小鼠适应性喂养1周，运用完全随机方法，分为对照组、AD模型组和治疗组，每组8只。采用小鼠双侧侧脑室注射Aβ25～35蛋白的方法制备AD模型。小鼠麻醉后，双侧侧脑室（以前囟为起点，沿矢状缝后移0.5 mm，然后侧移1.1 mm，垂直进针3.0 mm）各缓慢注射3 μL聚合态Aβ25～35溶液，对照组双侧侧脑室注射等量生理盐水。

1.5 给药方法

造模后第3天开始灌胃，治疗组小鼠给予95%黑水缬草粗提物（用2%吐温80溶液做溶剂配成0.1 g/mL溶液）2 g/kg，AD模型组和对照组给予等量的2%吐温80溶液。每日1次，实验进行30 d。

1.6 Morris水迷宫

实验进行6 d，期间小鼠正常灌胃给药。前5 d进行定位航行实验，每日2次，观察小鼠的运动轨迹，若60 s内小鼠未寻到平台，则将其引导致平台，并在上面停留10 s。第6天进行空间探索实验，撤去水中平台，观察并记录小鼠60 s内穿越原平台所在位置的次数及在此象限的停留时间。

1.7 样品的采集与预处理

小鼠乙醚麻醉，去眼球取血置于1.5 mL离心管（EP内涂肝素），离心10 min（4℃，12 000 r/min），取上清液，置于-80℃冰箱保存。预处理：取100 μL样品加入200 μL乙腈，涡旋，离心，取上清后，于氮气下吹干，用100 μL初始流动相复溶，再次涡旋，离心，取上清，重复2次，后取5 μL进入液相色谱系统。

1.8 色谱和质谱条件

色谱条件：ACQUITY UPLCRBEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm Waters，Made in Ire1and），流动相A1为0.1%甲酸水，B1为0.1%甲酸乙腈，流速0.25 mL/min。梯度洗脱：0 min，80%A1；0～1 min，50%～80%A1；1.0～4.5 min，35%～50%A1；4.5～12.0 min，0%～35%A1；12～13 min，0～80%A1；13～14 min，80%A1。进样量5.0 μL，柱温30℃。

质谱条件：采用正离子全扫描方式，扫描范围m/z 100～1000。ESI为离子源，毛细管电压3.2 V，锥孔电压30 V；脱溶剂气为氮气，流速600 L/h，温度350℃。同时进行MS/MS二级扫描获得多级质谱碎片信息。

1.9 统计学方法

水迷宫数据经SPSS 19.0分析，计量资料用均数±标准差（）表示，三组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用Tukey检验，方差不齐时采用K-W检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。代谢组学数据：运用MassLynx V4.1对数据分析，经主成分分析（PCA）得到得分图及载荷图，再根据载荷图上对各组分组起重要作用的点进行二级扫描，根据二级图谱，查找相关的数据库（HMDB http：//www.hmdb.ca/和LIPID MAPS http：//www.1ipidmaps.org/等），从而得出AD的潜在生物标志物。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

随着训练天数的增加，与对照组小鼠比较，AD模型组小鼠的逃避潜伏期显著延长，且其在目标象限内停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。与AD模型组小鼠比较，治疗组小鼠逃避潜伏期明显缩短，在目标象限内停留时间显著延长，穿越平台次数明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 小鼠血浆UPLC-MS分析

2.2.1 血浆代谢组学分析PCA得分图分析，对照组和AD模型组完全分开，界限明显，治疗组处于对照组和AD模型组之间，证明黑水缬草提取物干预后AD小鼠血浆代谢物发生明显变化。见图1。

表1 黑水缬草提取物对AD模型小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间及穿越平台次数的影响（）

表1 黑水缬草提取物对AD模型小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间及穿越平台次数的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与AD模型相，**P＜0.05；AD：阿尔茨海默病

组别只数目标象限停留时间（s）逃避潜伏期（s）第1天第2天第3天第4天第5天穿越平台次数（次）对照组AD模型组治疗组8 8 8 58.90±0.05 59.92±0.07 59.90±0.05 42.76±10.50 57.45±5.26 54.40±9.55**34.08±10.34 50.53±5.34*43.10±10.40**29.65±9.49 43.02±9.65*35.19±3.35**22.42±6.25 40.25±6.64*32.81±4.33**19.07±6.08 11.84±4.69*15.68±4.54**5.00±1.05 2.00±0.82*3.90±1.52**

图1 三组主成分分析后得到的得分图

2.2.2 潜在生物标志物鉴定经PCA分析，确定了10种生物标志物。标志物的峰强度及黑水缬草作用后峰强度的变化见图2。

图2 三组潜在生物标志物的峰强度

3 讨论

AD病因及发病机制复杂，目前尚缺乏有效的治疗药物。中药及其提取物质具有多靶点、多途径、多方式等作用特点，已成为人们研究的热点。

本研究通过水迷宫实验发现，与对照组比较，AD小鼠学习记忆及空间探索能力明显下降，黑水缬草提取物干预后，小鼠学习记忆及空间探索能力明显提高，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明黑水缬草提取物可改善AD小鼠的学习记忆及认知功能。以上实验表明Aβ小鼠造模成功，具备AD的典型行为学改变，同时说明了黑水缬草对AD具有治疗作用。

本研究运用UPLC-MS技术研究AD小鼠血浆代谢物的变化。确定了10种AD血浆生物标志物，经黑水缬草作用后，AD小鼠血浆中的10种标志物的含量均明显增加，表明黑水缬草对AD有治疗作用，其作用与氨基酸、磷脂和鞘脂代谢等某些代谢特定通路的调控作用有关。

组氨酸是一种重要的氨基酸，同时它是许多生物活性物质的前体物质，如组胺。有大量研究显示，组胺能神经元系统与精神和神经退行性疾病（AD、帕金森病、亨廷顿舞蹈症）有关［5-7］。近年来有研究发现，AD患者血中组胺浓度升高，其有可能是疾病初期机体的代偿机制所致，或是因携带载脂蛋白E4等位基因的AD患者血脑屏障被破坏所致［8］。本研究发现AD小鼠血浆组氨酸含量明显下降，黑水缬草提取物干预后，组氨酸含量呈上升趋势，从代谢水平上证明了黑水缬草对AD有治疗作用。以上研究表明组胺能神经系统受损与AD关系密切，可能是AD的发病机制之一，组氨酸是AD的潜在生物标志物。

磷脂代谢异常是AD的特征性病理学变化之一［9］。溶血卵磷脂（LPC）是细胞膜磷脂的降解产物，在维持膜的稳定性中起重要作用，同时它也是重要的生物活性物质，参与细胞多种信号转导过程。有研究表明LPC能引起神经元鞘脱髓鞘、轴突变性和神经元凋亡等［10］。LPC是磷脂酶A2（PLA2）的催化产物，其生成后迅速被乙酰辅酶A乙酰化形成维持神经元细胞膜的重要成分。有研究发现AD患者脑内顶部及颞叶部乙酰辅酶A活性增强［11］，同时又有研究发现多种血浆LPC对PLA2活性具有抑制作用［12］。多位学者发现AD患者血浆中LPC含量下降［13-16］。本实验结果表明黑水缬草通过调控LPC的代谢，改善AD的症状。

鞘氨醇是复杂神经鞘脂类合成的前体物质［17］，而鞘脂类是一类重要的信号分子，参与多种生理功能调节，例如神经元生长、细胞识别、信号转导等［18］。有研究发现AD患者脑组织和血浆中神经酰胺含量升高［19-20］。另有学者发现AD小鼠血浆中鞘脂类含量下降［13］。在本研究中，AD小鼠血浆中十六碳鞘磷脂、二氢神经鞘氨醇、4-羟双氢（神经）鞘氨醇（C18、C20）含量显著下降，其均属于神经鞘脂类，在细胞功能的维持中起着一系列至关重要作用。而黑水缬草提取物治疗后四者含量均明显上升，证明黑水缬草提取物通过干预AD小鼠的脂质代谢，从而起到抗AD作用。

本研究运用UPLC-MS/MS技术对黑水缬草提取物干预的Aβ23～35小鼠模型血浆代谢物谱进行分析，确定了10种AD的生物标志物，并发现黑水缬草提取物是通过干预氨基酸、磷脂、鞘脂等相关代谢通路治疗AD。

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Metabonomics study on the effect of Valeriana amurensis extractive for model mice with Alzheimer disease

WANG Zhe1LI Wei2LI Jingyuan1LI Lin1LI Naijing1
1.Department of Cadre Ward，Shengjing Hospita1 of China Medica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China；2.Teaching and Research Office of Pharmaceutica1 Ana1ysis，Shenyang Pharmaceutica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Valeriana amurensis extractive for A1zheimer disease（AD）by u1tra-performance 1iquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS）.Methods KM ma1e mice were divided into three groups：contro1 group（2%Tween-80 so1vent），AD mode1 group（2%Tween-80 so1vent），treatment group（95%EtOH extract of Valeriana amurensis 2 g/kg），a11 mice were given drugs by gavage for 30 days.Morris water maze and UPLC-MS/MS technique were conducted in the experiment.Results In the p1ace navigation test，mice in the AD group took much more time to reach the p1atform on the 1ast three training days compared to the contro1 group（P＜0.05）.The treatment group reduced escape 1atency compared to the AD group on 1ast 4 days（P＜0.05）.In the spatia1 exp1oration test，the tota1 time spent in the target quadrant and the number of mice that exact1y crossed the previous position of the p1atform in AD mode1 group were c1ear1y shorter and 1ower than those of the contro1 group（P＜0.05）.However，mice in the treatment group showed 1onger time spent in the target quadrant and higher frequencies of p1atform crossings compared to the AD group（P＜0.05）.By means of UPLC-MS，a tota1 of ten kinds of ana1ytes were identified，which were L-Histidine，C18 PHS，Hexadecasphinganine，LPC C22∶6，LPC C18∶2，LPC C16∶0，LPC C20∶4，LPC C18∶1，dihydrosphingosine and C20 PHS.When compared to contro1 group，the 1eve1s of ten kinds of markers in AD mode1 group were significant1y reduced（P＜0.05 or P＜0.01）.But the contents of ten kinds of markers in mice p1asma in the treatment group were obvious1y increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Valeriana amurensis extract can improve the cognitive function of AD mice，its mechanism is c1ose1y re1ated to amino acids，phospho-1ipids and sheath 1ipid metabo1ism as we11 as re1ated metabo1ic pathways.

A1zheimer disease；Valeriana amurensis；Metabo1omics；Biomarkers

R749.16

A

1673-7210（2016）07（c）-0004-04

2016-02-29本文编辑：张瑜杰）

国家自然科学基金资助项目（81203002）。

王喆（1989-），女，中国医科大学附属盛京医院2014级老年医学专业在读硕士研究生；研究方向：老年医学。

李乃静（1972-），女，博士，教授；研究方向：老年医学。