一种改良的镰形棘豆DNA提取方法*

黄聪琳，郭 敏，王晓琳，姜 华

1甘肃省中医院，甘肃 兰州，730050；2甘肃省中医药研究院

一种改良的镰形棘豆DNA提取方法*

黄聪琳1，2，郭 敏1，2，王晓琳1，2，姜 华2

1甘肃省中医院，甘肃 兰州，730050；2甘肃省中医药研究院

目的：建立适合DNA条形码分析的镰形棘豆DNA提取方法。方法：以镰形棘豆（Oxytropis falcate Bunge）叶片为材料，采用改良的DNA提取方法对其DNA进行提取，并用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对提取的DNA进行检测。结果：本方法提取的DNA，能够满足以PCR为基础的分子鉴定的基本要求。操作简便，需时短，成本低廉，适于DNA的大批量提取。结论：本方法适合DNA条形码研究的DNA提取。

镰形棘豆；DNA提取；PCR扩增

DNA是重要的遗传物质，是中草药的DNA条形码鉴定、RAPD分析、PCR扩增、指纹图谱等多方面分子生物学研究的基础。尤其在大通量的分析中，快速获得大量的DNA显得极为重要。

传统的提取植物的DNA方法有CTAB法［1］、SDS法、苯酚法等［2］，但操作步骤多，耗时长。试剂盒法提取DNA，纯度高，但成本昂贵，不适合大批量提取。

棘豆属(Oxytropis)植物为豆科较大的药用属之一［3］，其中镰形棘豆(Oxytropis falcate Bunge)为豆科棘豆属植物的干燥全草，主要产于我国青海、甘肃南部、四川西部，藏药称为“莪达夏”，现为《中华人民共和国卫生部药品标准》(藏药)第一册收载品种［4］。该药材总黄酮、生物碱等成分具有抗菌抗氧化、消炎止咳、抗肿瘤等活性［5-7］。

本研究探讨适于DNA大批量提取的改良DNA提取方法对镰形棘豆DNA进行提取，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料 新鲜镰形棘豆采自甘肃省甘南藏族自治州合作地区，经兰州大学生命科学学院副教授盛红梅鉴定为镰形棘豆。

1.2 主要试剂和仪器 三羟甲基氨基甲烷(Tris，天津市致远化学试剂有限公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA，天津市光复精细化工有限公司)、十二烷基磺酸钠(SDS，天津市光复精细化工有限公司)、盐酸、氯化钠、异丙醇等(天津市百世化工有限公司)均为分析纯。低温高速离心机(Eppendorf，德国)；恒温水浴锅(科哲，中国上海)；水平电泳仪(伯乐Bi o-Rad，美国)；凝胶成像系统(伯乐Bi o-Rad，美国)；PCR仪(伯乐Bi o-Rad，美国)。

1.3 方法

1.3.1 提取缓冲液配制 提取缓冲液配方见表1。

表1 提取缓冲液配方

1.3.2 DNA提取 1)称取100 m g新鲜叶片，置灭菌Eppendorf管中，于20s内迅速研磨成匀浆；2)加入400 μL提取缓冲液后，涡旋或剧烈振荡5 s，然后放置室温，待所有样本处理完毕；3)13000r/m i n离心1分钟；4)小心吸取300 μL上清液转移入另一灭菌Eppendorf管，加入300 μL异丙醇，室温搁置2分钟；5)13000r/m i n离心5分钟。弃去上清，室温干燥；6)沉淀用100μL 1×TE或重蒸水溶解。

1.3.3 DNA检测

1.3.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测 用琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的片段大小、降解情况及浓度。配制1.0%的琼脂糖凝胶，取5μL DNA原液，与1μL 6×上样缓冲液混匀，上样，用DS 2000 Marker作为标准，120 V恒定电压30分钟后，用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.3.2 PCR扩增检测 ITS2基因编码一段核糖体DNA，被广泛应用于物种的分子鉴定［8-10］，利用该基因的PCR扩增效果检测所提取的DNA的质量。PCR反应体系(25 μL)包括：10×缓冲液2.5μL，dN TP(2.5 m m ol/L)0.5μL，Taq聚合酶(5U/L) 0.5 μL，ITS2上下游引物(1 μm ol/L)各0.5 μL，ddH2O 20μL，模板DNA 0.5 μL。反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸5分钟，4℃保存扩增产物。取5 μL PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上水平电泳(120 V恒定电压30分钟)，用凝胶成像系统观察并拍照，引物序列见表2。

表2 引物及序列

2 结果

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳显示，每个样本都有1条高分子量条带，植物总DNA条带清晰可见，说明本法能够提取相对完整的DNA，见图1。

图1 提取的新鲜镰形棘豆基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 PCR扩增 以本法提取的DNA为模板，进行PCR扩增，均获得了清晰的扩增条带。从琼脂糖凝胶电泳看，提取的总DNA虽然有部分降解，但以ITS2引物进行PCR扩增，能够得到清晰的目的条带，说明提取的DNA完全可以作为PCR的模板使用，见图2。

图2 PCR扩增产物电泳图

3 讨论

在植物药材的分子鉴定、作物的分子育种、突变体筛选等研究中，通常需要大样本量的DNA，本法操作简单、方便，可以快速获得植物总DNA。在诸多需要通过PCR扩增进行检测鉴定的研究工作中，此法提取的DNA质量足以作为PCR模板使用。在成本方面远低于试剂盒提取法。另外，本方法避免使用酚、氯仿、高氯酸钠、异硫氰酸胍等有毒有机试剂，减少了人体伤害和环境污染。提取的总DNA通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测，结果表明本法提取的新鲜镰形棘豆基因组DNA能满足普通的PCR扩增实验，可用于大批量新鲜中草药，尤其是叶片样本的DNA提取。

本方法的特点是：1)操作简便，在室温条件操作即可；2)需时很短，全部操作在1个小时内即可完成；3)可以用于多种新鲜植物组织DNA提取，尤其对于幼嫩叶片，效果更佳；4)分离效果好，多数情况提取的DNA纯度都较理想，完全可以满足PCR扩增的模板要求。

［1］Doyle JJ.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochem Bull，1987，19：11-15.

［2］孙璐宏，鲁周民，张丽.植物基因组DNA提取与纯化研究进展［J］.西北林学院学报，2010，25（6）：102-106.

［3］刘斌.中国棘豆属药用植物及其现代研究［J］.中国野生植物资源，1997，16（2）：15-18.

［4］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）第一册［M］.北京：中华人民共和国卫生部，1995：101.

［5］Jiang H，Hu JR，Zhan WQ，et al.Screening for fractions of oxytropis falcata bunge with antibacterial ac-tivity［J］.Natural Product Research，2009，23（10）：953-959.

［6］姜华，张丽，黄聪琳，等.藏药镰形棘豆总黄酮苷元急性毒性实验研究［J］.西部中医药，2013，26（8）：50-52.

［7］王栋，杨欢，童丽，等.藏药镰形棘豆的镇痛抗炎活性［J］.药学与临床研究，2008，16（2）：90-93.

［8］CPB Group，Li DZ，Gao LM，et al.Comparative analysis of a largedataset indicates that internal transcri bed spacer（ITS）should be incorporated into the corebarcode for seed plants［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（49）：19641-19646.

［9］石林春，陈俊，向丽，等.基于ITS2条形码的中药材天南星及其混伪品DNA分子鉴定［J］.中国中药杂志，2014，39（12）：2176-2179.

［10］赵莎，庞晓慧，宋经元，等.应用ITS2条形码鉴定中药材合欢皮、合欢花及其混伪品［J］.中国中药杂志，2014，39（12）：2164-2168.

A Modified DNA Extraction for LianXing JiDou

HUANG Conglin1，2，GUO Min1，2，WANG Xiaolin1，2，JIANG Hua2
1 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine

Objective:To establish a DNA extraction method from LianXing JiDou （Oxytropis falcate Bunge）for DNA bar code analysis.Methods:Leaves of LianXing JiDou were used to extract DNA by using a modified DNA method；agarose gel electrophoresis and PCR amplification were used to detect extracted DNA.Results:The DNA extracted by this method could meet basic requirements for PCR molecular identification.The method is simple，time-saving，and low-cost；it is suitable for extraction in large quantities.Conclusion:This method is a proper method of DNA extraction for bar code analysis.

LianXing JiDou；DNA extraction；PCR amplification

R285.2

A

1004-6852（2016）09-0034-03

2015-06-25

甘肃省中医药科研立项课题（编号G ZK-2012-71）；甘肃省中医院博士启动基金项目（编号博2013-9）。

黄聪琳（1983—），女，博士学位，助理研究员。研究方向：药用植物分子生物学。