禽用乳酸菌的筛选与功能鉴定

冯会贤，梅星星，蒋瑞瑞，郭克豹，孙向丽，康相涛，王彦彬

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南 郑州 450002；2 河南省信阳市平桥区畜牧局，河南 信阳 464000)



禽用乳酸菌的筛选与功能鉴定

冯会贤1，梅星星1，蒋瑞瑞1，郭克豹2，孙向丽1，康相涛1，王彦彬1

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南 郑州 450002；2 河南省信阳市平桥区畜牧局，河南 信阳 464000)

【目的】 从健康鸡肠道中分离筛选优质乳酸菌，为制备禽用微生态制剂提供技术支持。【方法】 选用30日龄健康青年鸡，取其盲肠内容物，通过选择性培养基筛选出具有产酸能力的乳酸菌，对其进行耐pH 3.0胃酸和3 g/L牛胆盐筛选试验及菌株生长曲线、产酸能力测定，并通过平板抑菌试验筛选出具有较强抑菌效果的菌株。最后对此菌株16S rRNA进行克隆测序，经Blast比对和系统进化树分析，对菌株进行鉴定。【结果】 从所取鸡盲肠内容物中分离得到L1～L9 9株乳酸菌，其中L2、L4和L9株耐pH 3.0和3 g/L牛胆盐的综合能力较强。经过比较3株菌的生长曲线和产酸曲线，发现L2菌株耐酸耐牛胆盐、生长迅速、产酸能力强，且具有较强的抑制致病性大肠埃希菌的活性。经16S rRNA序列比对和系统进化树鉴定，确定L2为唾液乳酸杆菌。【结论】 成功筛选出了1株可用以研制禽用微生态制剂的乳酸菌菌株。

乳酸菌；16S rRNA；大肠杆菌；鸡

鸡大肠埃希菌病是引起鸡生长缓慢和死亡的重要疾病之一，制约着养禽业的发展。生产中常采取抗生素治疗该病，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了肠道内正常微生物菌群的平衡，因而增加了其他消化道疾病的发生率，甚至出现了一旦不用抗生素，鸡群就发病的怪现象，导致抗生素滥用。另外，抗生素滥用会引起动物肠道病原微生物产生耐药性，并造成动物免疫力下降，导致畜禽产品中药物残留增加以及环境污染等系列问题，进而使畜禽产品在国际市场的竞争力下降，并对人类健康造成潜在威胁[1]。因此，开发无毒无副作用以及无残留的抗生素替代品已成为当前的研究热点。

以益生菌组成的微生态制剂作为抗生素替代品的首选已被多数从业人员所认可。1998年美国饲料管制协会(AAFCO)鉴定公布了43种可用作微生态制剂的菌种，其中半数以上是乳酸菌[2]。乳酸菌作为益生菌的一种，可调节消化道微生态平衡、拮抗病原微生物[3-4]、促进营养成分在动物体内的分解吸收[5]、降低血清中的胆固醇含量[6]，而且还有抗肿瘤作用[7-8]。 乳酸菌是动物消化道内的主要共生菌之一，已作为饲料微生物添加剂广泛应用于动物养殖中[9],其进入畜禽肠道后能够与病原菌相互竞争营养物质，阻止病原菌获得其生长增殖所需的营养元素，还能够产生如挥发性脂肪酸和乳酸等一系列有机酸，使肠道内的pH降低，从而抑制大肠埃希菌等致病菌的增殖[10]。目前市场上以乳酸菌为主的微生态制剂大多数适用于哺乳动物，但由于家禽独特的消化系统特点，这些制剂在家禽上的应用具有一定的局限性，实际应用效果不理想。因此研制禽用微生态制剂具有重要意义。

本研究从家禽肠道微生物中分离出乳酸菌，并模拟家禽胃肠道环境对分离到的菌株进行耐酸和耐胆盐筛选，对筛选出的优势菌株进行生长性能、产酸能力以及抗菌活性测定，以期得到耐胃肠道环境且生长迅速、产酸能力强、抗菌效果好的禽用乳酸菌菌株，为开发应用于防治家禽细菌性消化道疾病的微生态制剂提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

MRS肉汤、乳酸菌选择性分离培养基、pGEM-T载体、pfu酶和DH5α感受态细胞，均购自宝赛生物；大肠埃希菌菌株ATCC25922和肠炎沙门氏菌，由河南农业大学微生物教研室提供；碳酸钙、牛胆盐、盐酸、氢氧化钠等均为化学纯试剂。

精密酸度PHS-3C计，购自上海理达仪器厂；麦氏比浊仪WI93008，购自东西仪(北京)科技有限公司；紫外可见分光光度计UV9100B，购自北京莱伯泰科仪器有限公司；牛津杯，购自上海生工。

1.2方法

1.2.1菌株的分离纯化与形态鉴定取30日龄健康青年鸡盲肠内容物1.00 g，用5 mL无菌水稀释后，用纱布过滤以除去内容物中的固体残渣。取 0.5 mL滤液依次用无菌水进行10倍倍比稀释至10-7，取10-5、10-6、10-73个稀释度稀释液各100 μL，均匀涂布于准备好的乳酸菌选择性分离培养基平板上，37 ℃厌氧培养24～48 h，分离出具有溶钙圈的单菌落，并进行反复划线纯化，直至得到纯菌落。

对分离到的乳酸菌进行菌落形态观察，并对分离的单菌落进行革兰氏染色，油镜下观察细菌的形态及染色情况，并根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》进行鉴定。

1.2.2分离菌株的耐酸耐牛胆盐初筛配制牛胆盐质量浓度为0.0(对照)，3.0 g/L和pH值为6.3(对照)，3.0的MRS培养基。用麦氏比浊仪WI93008将初筛得到的乳酸菌菌液密度调整为1.0×108CFU/mL，分别取200 μL相应的乳酸菌悬液于上述不同pH和牛胆盐质量浓度的MRS培养基中，每组3个重复，37 ℃厌氧培养12 h后用紫外可见分光光度计UV9100B于600 nm处检测菌液吸光值OD600。

1.2.3初筛菌株在酸和牛胆盐环境中的抗性[11]分别配制牛胆盐质量浓度为0.0，1.0，2.0，3.0 g/L和pH值为3.0，4.0，5.0，6.3(对照)，7.0的MRS培养基。 用麦氏比浊仪WI93008将初筛得到的乳酸菌菌液密度调整为2.0×108CFU/mL，分别取300 μL相应的乳酸菌悬液于上述不同pH和牛胆盐质量浓度的MRS培养基中，每组3个重复，37 ℃厌氧培养4 h后用紫外可见分光光度计UV9100B于600 nm处检测菌液吸光值OD600。

1.2.4耐酸耐牛胆盐菌株生长曲线及产酸曲线分别取耐pH 3.0酸和3.0 g/L胆盐的菌液300 μL(2.0×108CFU/mL)于100 mL MRS培养基中，37 ℃厌氧静置培养，每隔4 h取1次样，连续取72 h，用紫外可见分光光度计UV9100B测定各样品的OD600值，绘制该菌株的生长曲线；用精密酸度计PHS-3C检测48 h内所取菌液的pH值，绘制其产酸曲线。

1.2.5菌株体外抑菌活性的测定[12-13]将标准大肠埃希菌菌株ATCC25922和肠炎沙门氏菌分别接种于营养肉汤中，200 r/min摇床过夜培养后，用麦氏比浊仪WI93008将菌液密度调至1.0×108CFU/mL，取100 μL菌液均匀涂布于LB琼脂平板上，37 ℃干燥30 min后，在平板上均匀放置3个灭菌牛津杯，将培养16 h的乳酸菌液加入牛津杯至刚满，小心置于37 ℃恒温培养箱培养12～16 h，测量抑菌圈的直径，用无菌MRS作对照。抑菌活性判定标准为：抑菌圈直径≤5 mm为抑菌性弱，抑菌圈直径>5～≤10 mm为抑菌性较弱，抑菌圈直径>10～<15 mm为抑菌性较强，抑菌圈直径≥15 mm为抑菌性强。

1.2.616S rRNA序列鉴定及系统进化树构建用16S rRNA通用引物16S 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S 1525r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)扩增乳酸菌16S rRNA片段，PCR反应体系为10 μL：2×pfuMix 5 μL，16S 27f(10 μmol/L)0.2 μL，16S 1525r(10 μmol/L)0.2 μL，菌液1 μL，无菌水3.6 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，56.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，DNA Green染色，检测产物大小。用DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，用微量紫外分光光度计检测纯化产物浓度。将纯化产物与pGEM-T载体连接，随后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑试验筛选后，挑取阳性克隆菌以通用引物M13(M13f：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′；M13r：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)进行PCR扩增，并选取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，将乳酸菌16S rRNA测序结果用Blast进行同源性比对，对得到的同源性较高的序列采用MEGA 5.0构建进化树。

1.3数据处理

用Excel 2013处理乳酸菌耐酸耐胆盐特性和生长曲线及产酸曲线数据。

2　结果与分析

2.1乳酸菌的筛选

试验发现，37 ℃厌氧培养16～24 h后，乳酸菌选择性分离培养基上形成了边缘整齐、表面光滑、有溶钙圈、整齐度均一的乳白色圆形菌落(图1-A)，将分离菌株进行革兰氏染色，油镜下可见呈杆状的革兰氏阳性菌，单个或呈短链状排列(图1-B)。试验共分离得到9株乳酸菌(L1～L9)，图2为9株乳酸菌在pH 3.0和3.0 g/L牛胆盐模拟胃肠道环境中的生长状况。由图2可见,分离出的9株菌耐酸和耐牛胆盐的能力有所差异，耐pH 3.0较好的菌株为L2、L4、L6、L7、L8、L9，耐3.0 g/L牛胆盐较好的菌株为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L9，综合认为L2、L4、L9 3株菌耐酸和耐牛胆盐的能力较好。图3为L2、L4、L9菌株对模拟胃肠道环境耐受力的表现。

图 1　家禽消化道分离得到乳酸菌的菌落形态

图 2　禽消化道分离得到的9株乳酸菌在模拟胃肠道环境中的生长情况

图 3　禽消化道分离乳酸菌耐梯度酸和牛胆盐特性

2.2优势菌株L2、L4和L9的生长曲线

由图4可知，分离乳酸菌株L2、L4、L9的潜伏期均很短，很快就进入对数生长期。L2、L9菌株前16 h生长迅速，OD600值直线上升；16～44 h，除L9在40 h出现一个峰值外，L2、L4菌体密度基本趋于平衡，OD600值稳定在2.5左右；44～72 h细菌生长进入衰亡期，菌体迅速死亡。L4菌株前10 h生长较快，10～48 h期间OD600值基本稳定在2.2左右，随后即进入菌体衰亡期；菌株L9较L2稍早进入稳定期，在30～44 h期间L2菌株有缓慢生长的趋势，OD600值基本维持在2.5左右。

图 4　禽消化道筛选所得优势乳酸菌菌株L2、L4、L9 72 h生长曲线

2.3优势菌株L2、L4和L9的产酸曲线

MRS液体培养基的初始pH为6.37，加入细菌密度为2.0×108CFU/mL的L2、L4、L9菌液300 μL后pH分别变为6.01，6.21和6.17。由图5可见，37 ℃厌氧培养条件下，3株菌前16 h很快进入对数生长期，代谢速度加快，产酸量明显增加，pH值迅速下降，其中L2菌株最为明显；16 h后L4、L9菌株几乎不再产酸，pH稳定在4.5左右，而L2菌株继续产酸但产酸量明显减少，pH值下降缓慢，36 h以后，菌体几乎不再产酸，pH趋于稳定，维持在3.7左右。

图 5　禽消化道筛选所得优势乳酸菌菌株L2、L4、L9 48 h产酸曲线

2.4优势菌株L2、L4和L9的抑菌活性

经测定，菌株L2、L4、L9对大肠埃希菌ATCC25922的抑菌圈直径分别为18，9，和8 mm，对肠炎沙门氏菌的抑菌圈直径分别为6，0和8 mm(图6)。可知，L2菌株对大肠埃希菌ATCC25922具有较强的抑制作用，而L4、L10菌株对大肠埃希菌也有一定程度的抑制作用，但抑菌作用较弱；3株菌对肠炎沙门氏菌的抑制效果均不如对大肠埃希菌ATCC25922的抑制效果，其中L2、L10对肠炎沙门氏菌的抑菌作用较弱，而L4对肠炎沙门氏菌几乎无抑菌作用。

图 6　禽消化道分离所得优势菌株L2、L4、L9对大肠埃希菌和肠炎沙门氏菌的抑菌效果

2.5L2菌株的16S rRNA序列鉴定及进化分析

经PCR扩增得到L2菌株16S rRNA全长序列，约为1 500 bp(图7),经测序后，在NCBI的GenBank核酸序列数据库中进行Blast序列比对。结果显示，L2菌株与唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius)的16S rRNA序列同源性达到99%。结合形态学特征，可判定为同种。由系统进化树(图8)可知，来自人、鸡、猪胃肠道的唾液乳酸杆菌具有很高的同源性。

图 7禽消化道分离所得优势乳酸菌菌株L2 16SrRNA 序列PCR产物电泳结果

M.Marker;1.L2菌株

Fig.7Electrophoresis of the 16S rRNA PCR product of the L2 strain selected from digestive tract of poultry

M.Marker;1.L2 strain

图 8乳酸菌菌株L2与同源性较高细菌16SrRNA序列的系统进化树

AB612958、AB612959.1、AB612967.1分离自家鸡肠道,DQ444477.1 分离自人胃,AB559623.1分离自猪盲肠;其他菌来源未知

Fig.8Phylogentic tree of 16S rRNA of L2 and other bacteria AB612958,AB612959.1 and AB612967.1 are isolated from chicken intestinal tract，DQ444477.1 was isolated from human

stomach,AB559623.1 was isolated from pig cecum;The origin of othersLactobacilluswas not reported

3　讨论与结论

目前，随着乳酸菌的广泛应用，对其研究也越来越深入，乳酸菌在增强机体免疫功能和预防消化道感染方面发挥着重要作用[14-16]。乳酸菌能通过细菌本身或细胞壁成分提高黏膜表面和血清中的IgA、IgM、IgG水平，增强体液免疫，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，加强细胞免疫[17]；还能够竞争性排斥病原菌的黏附、产生多种抑菌物质，进而起到预防肠道感染的作用[18]。

研究报道，乳酸菌在提高机体生长性能的同时[19]，对肠杆菌科细菌在肠道各部位的定殖水平有明显降低作用。有研究报道，乳酸菌代谢产生的乳酸和挥发性脂肪酸能够降低沙门氏菌在肠道的定殖水平[20]，进而影响到肠道微生物区系的平衡。乳酸菌素、乳酸、丙酸是乳酸菌在代谢过程中产生的抑菌物质，目前对乳酸菌拮抗致病菌机理研究较多的是乳酸菌素及乳酸菌产生的酸性物质。本研究中，与L4、L9菌株相比，L2菌株对大肠杆菌ATCC25922具有较强的抑制作用，可能就与其较强的产酸能力有关。

人们对乳酸菌的研究主要侧重于开发新菌株上，而Angelis等[21]则认为，若从菌种的安全性及对宿主肠道的黏附性方面考虑，乳酸菌菌种最好分离自宿主肠道内的优势菌群。而本研究中的菌株L2分离自健康鸡盲肠内容物，其在模拟胃肠道环境中能够耐受pH 3.0和3 g/L牛胆盐；其对数生长期较长，产酸能力较强；L2 16S rRNA序列与唾液乳酸杆菌的同源性可达99%，其对大肠杆菌具有较强的抑制作用，也可在一定程度上抑制肠炎沙门氏菌的生长。

[1]Servin A L.Antagonistic activities ofLactobacilliandBifidobacteriaagainst microbial pathogens [J].FEMS Microbiol Rev,2004，28(4):405-440.

[2]Ewing W N.The living gut [M].England:University of Notinghan，1994：49.

[3]Sakamoto L,Igarashi M,Kimura K,et al.Suppressive effect ofLactobacillusgasseri OLL 2716(LG21)onHelicobacterpyloriinfection in humans [J].J Antimicro,2001,47(5):709-710.

[4]Kushal R,Anand S K,Chander H.Effect of the feeding microentrapped co-culture ofLactobacillusacidophilusandBifidobacteriumbifudumon the immune response and protection of mice infected withSalmonellatyphimurium[J].Dairy Sci Tech,2006,86:387-399.

[5]Fooks L J,Full R,Gibson G R.Prebiotics,probiotics and human gut microbiology [J].Int Dairy J,1999,9:53-61.

[6]Pereira D I,Cibson G R.Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria andBifidobacteriaisolated from the human gut [J].Appl Envir,2002,68(9):4689-4693.

[7]Park H D,Rhee C H.Antimutagenic activity ofLactobacillusplantarumKLAB2l isolated from kimchi Korean fermented vegetables [J].Biotechnology Letters,2001,23(19):1583-1589.

[8]Rafter J.Lactic acid bacteria and cancer:mechanistic perspective [J].Br J Nutr,2002,88:89-94.

[9]王晶，季海峰，王四新，等.饲用乳酸菌制剂的研究现状及在养猪生产中的应用 [J].动物营养与饲料科学，2010，37(3)：38-41.

Wang J,Ji H F,Wang S X,et al.Research status of feedingLactobacillusand its application in swine production [J].Animal Nutrition and Feed Science,2010,37(3):38-41.

[10]Isolauri E,Salminen S,Ouwehand A C.Microbial-gut interactions in health and disease [J].Clinical Gastroenterology,2004,18(2):299.

[11]Hyronimus B,Le Marrec C，Hadj Sassi A,et al.Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria [J].International Journal of Food Microbiology,2000,61(2):193-197.

[12]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程 [M].北京：北京大学出版社，2000.

Qian C R,Huang Y X.Laboratory experiments in microbiology [M].Beijing:Peking University Press,2000.

[13]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册 [M].北京：科学出版社，2001.

Ma X R,Su D M.Microbiological examination of drug handbook [M].Beijing:Science Press,2001.

[14]Geary T M,Brooks P H,Morgan D T,et al.Performance of weaner pigs fed ad libitum with liquid feed at different dry matter concentrations [J].Journal of the Science of Food & Agriculture,1996,72(1):17-24.

[15]Vanwinsen R L,Purlings B A,Lipman L A,et al.Effect of fe-rmented feed on the microbiol population of the gastrointestinal tracts of pigs [J].Applied and Environment Microbiology,2001,67(7):3071-3076.

[16]Fimland G,Johnsen L,Dalhus B,et al.Pediocin-like antimicro-bial peptides (class IIa bacteriocins) and their immunity proteins [J].Journal of Peptide Science,2005,11(11):688-696.

[17]陈世琼，李平兰.特殊性能乳酸菌在治疗仔猪腹泻中的应用前景 [J].饲料研究，2003(1)：20-22．

Chen S Q,Li P L.Application prospect of special properties of lactic acid bacteria in the treatment of diarrhea in piglets [J].Feed Research,2003(1):20-22.

[18]赵洪梅，杨金生，杨文涛，等.乳酸菌对肠粘膜免疫调节的影响 [J].吉林农业，2011(5)：328-329.

Zhao H M,Yang J S,Yang W T,et al.Effects of lactic acid bacteria on regulation of intestinal mucosal immunity [J].Jilin Agriculture,2011(5):328-329.

[19]Robinson P H,Erasmus L J.Effects of analyzable diet components on responses of lactating dairy cows toSaccharomycescerevisiaebased yeast products:a systematic review of the literature [J].Anim Feed Sci Technol,2009,149:185-198.

[20]Magnusson J,Strum K,Roos S,et al.Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria [J].FEMS Microbiol Lett,2003,219:129-135.

[21]Angelis M D,Siragusa S,Berloco M,et al.Selection of potential probioticLactobacillifrom pig feces to be used as additives in pelleted feeding [J].Research in Microbiology,2006,157:792-801.

Isolation and functional identification of lactic acid bacteria for poultry

FENG Huixian1,MEI Xingxing1,JIANG Ruirui1,GUO Kebao2,SUN Xiangli1,KANG Xiangtao1,WANG Yanbin1

(1HenanInnovativeEngineeringResearchingCenterofPoultryGermplasmResources,CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou，Henan450002,China;2TheBureauofAnimalHusbandryofPingqiaoDistrict,XinyangCity,HenanProvince,Xinyang,Henan464000,China)

【Objective】 A lactic acid bacteria was isolated from healthy chickens gut to provide technical support for preparing micro-ecological preparation used in poultry.【Method】 Samples were collected from cecum of 30 day old healthy chicken,and lactic acid producing bacteria were screened through selective medium.After being screened by resistance to pH 3.0 hydrochloric acid and 3 g/L bile salts,the growth and acidogenicity of screened strains were determined,and the strain with strong antibacterial ability was screened through plate bacteriostatic experiment.Finally,it was identified by 16S rRNA sequencing,blast alignment and phylogenetic analysis.【Result】 Nine lactic acid bacteria strains (L1-L9) were isolated from chicken cecum,and L2,L4 and L9 had strong resistance to 3 g/L bile salt and pH 3.0.After comparing the growth performance and acid production of the three bacteria,L2 strain was the best with fast growth,high acid producing ability,and strong activity in inhibiting pathogenicEscherichiacoli.L2 was identified asLactobacillussalivaby 16S rRNA and phylogenetic tree analysis.【Conclusion】 OneLactobacillus,which could be used for preparing micro-ecological preparation for poultry,was screened successfully.

Lactobacillus;16S rRNA;E.coli;poultry

时间:2016-08-0909:40DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.006

2015-03-12

河南省科技攻关项目(152102110058)

冯会贤(1988-)，女，河南林州人，在读硕士，主要从事动物微生物与分子免疫学研究。

E-mail：fhx19881011@126.com

王彦彬(1969-)，男，河南濮阳人，副教授，硕士生导师，主要从事动物微生物与分子免疫学研究。

E-mail：ybwang2008@126.com

S853

A

1671-9387(2016)09-0035-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0940.012.html