锯叶棕提取物对胶质瘤大鼠免疫的调节①

沈京莲　张红岩　车玉琴　朱　杰　彭沈君

(中国医科大学附属第四医院，沈阳110032)



锯叶棕提取物对胶质瘤大鼠免疫的调节①

沈京莲张红岩车玉琴朱杰彭沈君②

(中国医科大学附属第四医院，沈阳110032)

目的：观察锯叶棕提取物对大鼠体内胶质瘤的作用及其对免疫系统的影响。方法：制作SD大鼠皮下胶质瘤模型，加空白对照组共为4组，即空白对照组(n=10)、荷瘤组(n=10)、低剂量SR治疗组(n=10)、高剂量SR治疗组(n=10)。大鼠造模后饲养1周开始给予锯叶棕提取物及安慰剂，低剂量组50 mg/kg、隔日灌胃一次，高剂量组300 mg/kg、隔日灌胃1次，其他组给予相同剂量的蒸馏水灌胃。喂养大鼠4周后，处死大鼠后测瘤重、计算抑瘤率，TUNEL染色法检测肿瘤细胞凋亡，巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性检测方法检测脾巨噬细胞活性，流式细胞仪检测CD4阳性淋巴细胞。结果：①用药组与荷瘤组比较，瘤重明显减少(F=62.678，P=0.000)；高剂量组与低剂量组比较，抑瘤率明显提高。②荷瘤组肿瘤细胞凋亡明显偏少，用药组肿瘤细胞凋亡明显增加，且SR高剂量组细胞凋亡最多(F=1.287，P=0.000)。③荷瘤组与空白组比较，脾巨噬细胞活性明显下降，用药后脾巨噬细胞活性提高，与剂量呈正相关(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)。④荷瘤组与空白组比较，CD4阳性淋巴细胞百分率减少，用药后CD4阳性淋巴细胞百分率增加，与剂量呈正相关(F=207.294，P=0.000)。结论：锯叶棕提取物能调节机体免疫功能，从而杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡，药物浓度越大、其作用越明显。

胶质瘤；锯叶棕提取物(SR)；凋亡；巨噬细胞活性；CD4阳性淋巴细胞

胶质瘤有很强的侵袭性，手术后复发率高，化疗和放疗副作用大，故死亡率较高[1,2]。肿瘤与免疫功能密切相关，由于免疫功能异常，肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视、从而发展壮大[3]。由于存在血脑屏障，胶质瘤更易发生免疫逃逸，加强机体免疫功能在肿瘤的预防、治疗中起到重要作用。前期体外实验显示，锯叶棕提取物对人脑胶质瘤细胞具有明显的抑制作用[4]。巨噬细胞及CD4+细胞在肿瘤细胞免疫中有着重要作用，本实验旨在探索锯叶棕提取物对移植瘤大鼠体内胶质瘤及免疫系统的影响。

1　材料与方法

1.1材料GL261胶质瘤细胞株(由中国医科大学基础学院提供)，常规复苏传代培养。锯叶棕提取物(美国Calbioehem 公司)。健康雄性SD大鼠，体质量(230±20)g，由中国医科大学实验动物中心提供。试剂：RPMI1640培养基，DMEM培养基，胰蛋白酶(美国Gibco公司)；小牛血清，TUNEL原位末端标记试剂盒，PBS液自配，Hank′s液自配，PI(碘化丙啶)(美国Sigma公司)；所有抗体均购于美国SantaCruz公司。电子天平；CO2培养箱(美国)；液体闪烁仪(美国)；超净工作台(FormaScientific Ine)；倒置显微镜(Olympus)；光学显微镜及摄像系统(Leica DME)；全套生物组织自动脱水机；石蜡包埋机；图像分析系统；流式细胞仪(FACScan，BD公司)；低温离心机(Heraeus)；-70℃冰箱(Forma scientific)；恒温混匀器(Eppendorf产品)；微量加样器(德国EPpendorf公司)；超速台式离心机(Heraeus仪器公司)；细胞培养板：25 cm2细胞培养瓶，96孔培养板(Flow Laboratories,lrvine,CA)。

1.2实验方法

1.2.1造模体外37℃水浴中复苏培养的GL261胶质瘤细胞，按常规制成细胞悬液。调至2×106个/ml的瘤细胞，随机选取10只健康SD大鼠，每只用上述细胞悬液0.4 ml腹腔注射，约1周后接种大鼠的腹部明显增大、凸出。将其颈椎脱臼处死，固定于蜡板上，无菌抽取乳白色腹水液，经稀释、染色后，调整瘤细胞悬液浓度为6×106个/ml，随机选30只大鼠，在每只大鼠右前肢背侧皮下接种瘤细胞0.2 ml，其余10只作为空白对照组给予相同体积的生理盐水，于相同部位进行皮下注射。

1.2.2实验分组和给药将30只造模成功的大鼠随机分为3组，加空白对照组共为4组，即空白对照组(n=10)、荷瘤组(n=10)、低剂量SR治疗组(n=10)、高剂量SR治疗组(n=10)。大鼠造模后饲养1周开始给予锯叶棕提取物(低剂量组50 mg/kg、隔日灌胃1次，高剂量组300 mg/kg、隔日灌胃1次)，阴性对照组给予相同剂量的蒸馏水灌胃。喂养4周。手术前禁食12 h。

1.2.3大鼠体内抑瘤试验末次给药后24 h处死大鼠，称取大鼠体重，剥离瘤体，测瘤重，计算抑瘤率。

1.2.4TUNEL染色检测凋亡各组大鼠处死后，取肿瘤组织，石蜡包埋，制成4 μm的石蜡切片。①切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水。②新鲜配制3%H2O2，室温处理，蒸馏水洗涤2 min×3次。③标本片加0.01 mol/L Tris缓冲液(TBS) 1∶200新鲜稀释ProteinaseK 37℃，消化15 min，蒸馏水洗涤2 min，共4次。④标本片加标记缓冲液20 μl/片，以保持切片湿润。按每张切片取TDT和dUTP各1 μl，加入18 μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液20 μl/片，于盒中37℃标记2 h。⑤0.01 mol/L TBS洗涤2 min×3次。⑥加封闭液50 μl/片，室温30 min，甩掉封闭液，不洗。⑦用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后50 μl/片加至标本片上，放于湿盒中，37 ℃反应30 min。0.01 mol/L TBS洗涤2 min×3次。⑧用抗体稀释液1∶100稀释稀释SABC，混匀后50 μl/片加至标本片上，37℃反应 min。0.01 mol/L TBS洗涤2 min×4次。⑨取1 ml蒸馏水，分别加入DAB试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后至标本片上色5 min。水洗。⑩苏木素轻度复染。0.01 mol/L TBS洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。细胞核呈暗紫色为阳性细胞即凋亡细胞。

1.2.5巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性检测方法检测脾巨噬细胞活性末次给药后24 h，给予大鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液1.0 ml,1.5 h后处死，取脾、称重，计算脾指数。抽取大鼠腹腔液0.2 ml涂片，将涂片置于恒温37℃孵育箱中温育40 min，冲洗晾干，用吉姆萨-瑞特氏液染色15 min，蒸馏水冲洗晾干，在油镜下观察计数。吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%。吞噬指数=被吞噬鸡红细胞总数/200个巨噬细胞。

1.2.6流式细胞仪检测CD4阳性淋巴细胞末次给药后24 h，将大鼠经眼球取血1.5 ml，肝素抗凝，将外周血以等体积Hanks液稀释后，在试管内轻轻加入淋巴细胞分离液3 ml，2 000 r/min离心20 min，吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3 ml，混匀后1 500 r/min离心5 min。弃去上清，细胞加入0.5 ml RPMI1640培养基重悬，细胞计数仪计数，调整细胞浓度。24孔细胞培养板中，每孔加入5×105ml-1细胞，加入RPMI1640培养基至总体积1 ml，加入FITC标记的CD4抗体20 μl，室温避光孵育30 min，后加入1%BAS-PBS液洗涤，稀释至300 μl移入试管中，待作流式细胞术进行分析。

2　结果

2.1锯叶棕提取物的抑瘤作用表1结果显示：用药组与荷瘤组比较，瘤重明显减少(F=62.678，P=0.000)；高剂量组与低剂量组比较，抑瘤率明显增加。移植瘤重及抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

2.2TUNEL染色检测凋亡细胞凋亡计数法：细胞核呈暗紫色为阳性细胞即凋亡细胞，每个样品的切片随机取10个高倍视野(400倍)，记数凋亡细胞和阴性细胞的平均数，计算凋亡细胞所占的百分率，结果显示：用药组与荷瘤组比较，阳性细胞百分率明显增加，锯叶棕高剂量组增加的更多(F=1.287，P=0.000)，见图1、2。

2.3巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性检测方法检测脾巨噬细胞活性结果显示：荷瘤组的脾巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数明显减少，用药组的脾巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数明显增加，且与剂量存在正相关(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)，见表2。

GroupsQuantityWeight(g)Inhibitionrate(%)Tumor-bearing101.49±0.392LowdoseSR100.71±0.0671)52.35HighdoseSR100.36±0.0511)75.842)

Note：Compared with the tumor-bearing group,1)P<0.05；compared with the low dose SR group,2)P<0.05.

图1　各组肿瘤细胞凋亡百分比Fig.1　Percentage of apoptosis of tumor cells of each group

2.4流式细胞仪检测CD4阳性淋巴细胞结果显示：荷瘤组CD4阳性淋巴细胞百分率减少，用药后CD4阳性淋巴细胞百分率明显增加，且随着药物浓度的增加，CD4阳性淋巴细胞百分率升高(F=207.294，P=0.000)，见图3。

图2　各组肿瘤凋亡细胞的免疫组化图片(×400)Fig.2　Apoptosis of tumor cell in each group by immunohistochemistry analysis(×400)Note: Compared with the tumor group，the apoptosis of tumor cell dealed with SR increased，especially in high dose SR group.

GroupsQuantityPhagocyticpercentage(%)PhagocyticindexBlank1038.88±1.2900.95±0.091Tumor-bearing1036.53±0.8971)0.72±0.0711)LowdoseSR1044.32±2.3061)2)1.21±0.1171)2)HighdoseSR1049.89±1.5091)2)1.42±0.0431)2)

Note：Compared with the blank group,1)P<0.05；compared with the tumor group,2)P<0.05.

图3　SR对免疫细胞的影响Fig.3　Influence on immune cells of SR

3　讨论

免疫治疗已成为肿瘤治疗的大热点，简单的说就是利用患者自身免疫系统杀伤或抑制肿瘤细胞；异物入侵机体时会形成抗原，激发机体的免疫系统，但肿瘤会产生一些信号分子来迷惑机体的免疫系统,使其不能正常发挥作用，称之为免疫逃逸现象。肿瘤免疫治疗就是让机体免疫系统正常工作，最终控制和杀伤肿瘤细胞。在生理情况下，由于血脑屏障的存在，脑实质中极少有来自血液的免疫细胞，当肿瘤发生后，各种免疫细胞通过受损或开放的血脑屏障迁移至肿瘤区域[5-8]。

脑胶质瘤中的巨噬细胞主要来自外周血中的单核细胞，其次为脑膜巨噬细胞、血管周围巨噬细胞等[9]。胶质瘤造成了血脑屏障障碍,使巨噬细胞募集到肿瘤组织中，正常的巨噬细胞具有直接杀伤肿瘤、执行抗肿瘤天然免疫和诱导T细胞的抗肿瘤功能等，由于胶质瘤产生的巨噬细胞移动抑制因子、血管细胞黏附分子(VCAM-1)等因子，巨噬细胞的防护能力不但被抑制、甚至促进了肿瘤进展[10,11]。胶质瘤大鼠体内巨噬细胞的吞噬能力确实明显下降，在使用锯叶棕提取物后，巨噬细胞的吞噬能力明显提高，并与剂量呈正相关(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000)。

CD4+T细胞也是一种重要的抗肿瘤卫士，能够对肿瘤细胞产生细胞毒作用，在无CD8+T细胞存在的情况下，也能抑制肿瘤细胞[12]。此外CD4+T细胞能够分泌IL-2等及提供共刺激分子，激活CD8+T细胞[13，14]。但肿瘤产生的物质，如可溶性白细胞介素2(sIL-2R)竞争性结合IL-2，抑制T细胞的功能，使其不能发挥肿瘤抑制作用[15]。荷瘤组大鼠体内T细胞功能受抑制，CD4+T细胞百分比明显减少，经锯叶棕提取物治疗后的大鼠体内CD4+T细胞百分比明显升高，且与剂量呈正相关(F=207.294，P=0.000)。

肿瘤的免疫治疗是肿瘤治疗的未来趋势，从实验数据中可以看到，锯叶棕提取物不但阻止了肿瘤对巨噬细胞及T细胞的抑制作用，并增强这两种细胞的肿瘤杀伤能力，这给胶质瘤患者带来新的希望。

[1]Asthagiri AR,Pouratian N,etal.Advances in brain tumor surgery[J].Neurol Clin,2007，25(4):975-1003.

[2]Wen PY,Kesand S.Malignant gliomas in adults[J].Med,2008，359(5):492-507.

[3]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版西安公司，1996:69-71.

[4]Zhou T,Yang Y,Zhang H,etal.Serenoa repens induces growth arrest,apoptosis and inactivation of STAT3 signaling in human glioma cells[J].Technol Cancer Res Treat，2014，14(6)：729-736.

[5]Weller RO,Engelhardt B,Phillips MJ,etal.Lymphocyte targeting of the central nervous system:a review of afferent and efferent CNS-immune pathways[J].Brain Patho,1996，6(3):275-288.

[6]Trojan J,Johnson TR,Rudin SD,etal.Treatment and prevention of rat glioblastoma by immunogenic C6 cells expressing antisense insulin-like growth factor I RNA[J].Science,1993，259(5091):94-97.

[7]陈贤斌,涂明,王成德等.T细胞亚群和自然杀伤性细胞活性在脑胶质瘤患者中表达的意义[J].医学研究杂志,2013，42(1):90-91.

[8]徐宗华,游潮,徐善水，等.肿瘤相关巨噬细胞在人脑胶质瘤中的表达及意义[J].中华神经外科疾病研究杂志,2013，12(4):297-299.

[9]Prinz M,Priller J,Sisodia SS，etal.Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration[J].Nat Neurosci,2011，14(10):1227-1235.

[10]Bloom BR,Bennett B.Mechanism of a reaction in vitro associated with delayed-type hypersensitivity[J].Science,1966，153(3731):80-82.

[11]Solinas G,Germano G,Mantovani A，etal.Tumor-associated macrophages(TAM)as major players of the cancer-related inflammation[J].J Leukoc Biol,2009，86(5):1065-1073.

[12]Segal BM,Glass DD,Shevach EM，etal.Cutting Edge:IL-10-producing CD4+T cells mediate tumor rejection[J].J Immunol，2002，168(1):1-4.

[13]Sun JC,Williams MA,Bevan MJ，etal.CD4+T cells are required for the maintenance,not program ming,of memory CD8+T cells after acute infection[J].Nat Immunol,2004，5(9):927-933.

[14]宋杨英,张建军，陈颖，等.IL-18对9L胶质瘤细胞表面分子表达影响的体外实验[J].中国免疫学杂志，2014，30(6):749-753.

[15]Nakase K,Kita K,Otsuji A，etal.Diagnostic and clinical importance of interleukin-2 receptor alpha chain expression on non-T-cell acute leukaemia cells[J].Br J Haematol,1992，80(3):317-326.

[收稿2015-10-23修回2015-12-21]

(编辑倪鹏)

Regulation of saw palmetto extract on immune function in GL261 glioma

SHEN Jing-Lian,ZHANG Hong-Yan,CHE Yu-Qin,ZHU Jie,PENG Shen-Jun.

The Fourth Affiliated Hospital,China Medical University，Shenyang 110032,China

Objective:To investigate the effect of saw palmetto extract(SR) on GL261 glioma in rats and immune system.Methods: The 40 rats were divided into 4 groups randomly,one was the control group without tumor(the blank group)(n=10)，the other 30 rats were given subcutaneous inoculation of tumor cells and then divided into 3 groups:the tumor-bearing group(n=10),low dose SR group(n=10),and high dose SR group(n=10).After 1 week fed,the rats of SR groups were given the saw palmetto extract,low dose group 50 mg/kg once a day every other day and 300 mg/kg of high dose group every other day.The tumor-bearing groups received the same dose of distilled water.After 4 weeks fed,we measured the tumor weight and the inhibition rate was calculated.The tumor cell apoptosis was detected by TUNEL staining.The activity of splenic macrophages was detected by macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes and CD4+lymphocytes by flow cytometry.Results: ①The SR groups compared with tumor group,the tumor weight was significantly reduced(F=62.678,P=0.000).The tumor inhibition rate was significantly higher in high dose group.②The apoptosis of tumor cells in tumor-bearing group was significantly less than SR groups and the apoptosis was significantly increased after treatment with SR ,especially in high dose SR group(F=1.287，P=0.000).③Compared with the blank group,the macrophage activity decreased remarkablely.SR enhanced the macrophage activity obviously,positively related to doses of SR(F=141.205，P=0.000；F=126.903，P=0.000).④In the tumor-bearing group,the CD4+lymphocyte count decreased significantly.After SR treatment,the CD4+lymphocyte increased and were positively related to the dose of SR.Conclusion: Saw palmetto extract can strengthen the immune system.

Glioma;Saw palmetto extract(SR);Apoptosis;Macrophage activity;CD4+lymphocyte

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.012

沈京莲(1968年-)，女，副主任医师，主要从事脑血管病、肿瘤基础方面研究。

R739

A

1000-484X(2016)09-1299-04

①本文为辽宁省自然科学基金(2013021078)。

②辽宁中医药大学，沈阳110032。