异基因造血干细胞移植后骨髓免疫微环境重建研究①

赵潇溟　胡晓霞　王健民

(第二军医大学上海长海医院血液科，全军血液病研究所，上海200433)



·专家述评·

异基因造血干细胞移植后骨髓免疫微环境重建研究①

赵潇溟胡晓霞王健民

(第二军医大学上海长海医院血液科，全军血液病研究所，上海200433)

GVHD和GVL是影响异基因造血干细胞移植术成败的关键因素。骨髓不仅是造血器官，更是免疫器官，骨髓中的免疫微环境关乎移植后造血重建、免疫功能重建、移植后白血病复发。本文将从骨髓微环境的病理生理特点、异基因造血干细胞移植后免疫功能重建、骨髓免疫微环境与移植后造血恢复及移植后白血病复发等角度，综述近年来关于异基因造血干细胞移植后骨髓免疫微环境重建与造血重建和白血病复发相关研究情况。

骨髓；免疫；异基因造血干细胞移植；造血干细胞；白血病干细胞

赵潇溟(1990年-)，第二军医大学附属长海医院血液内科在读研究生， 2014年起师从王健民教授。主要从事异基因造血干细胞移植术后骨髓免疫微环境重建方面的研究。

胡晓霞(1979年-)，副教授，副主任医师，硕士生导师，第二军医大学附属长海医院血液内科副主任。2005～2007年在美国匹兹堡大学进修，主修造血干细胞生物学。2011年度入选“上海市卫生系统优秀青年人才培养计划”。主持国家自然科学基金3项，获军队医疗成果一等奖1项、上海市医学科技一等奖1项、天津市自然科学一等奖1项。授权实用新型专利2项。以第一作者(或共同第一作者)和共同通讯作者在《Blood》等血液学权威杂志发表SCI论文20余篇。现任中华医学会血液学分会青年委员、中华医学会血液学分会红细胞疾病组委员、上海市医学会血液学分会委员和上海市医学会血液学分会实验诊断学组秘书等职。临床以急性淋巴细胞白血病的精确诊断和治疗为亚专科方向，设计CHALL2013急性淋巴细胞白血病系统治疗方。2015年荣获第二军医大学首届“银听诊器”奖，并入选“研究型医师”。

急性白血病(Acute leukemia)是严重威胁人类生命健康的造血系统恶性肿瘤。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)在改善白血病患者无病生存率和总生存率方面远远优于常规化疗，是治疗白血病的有效方法，甚至是治愈某些白血病的唯一方法。但移植后白血病复发、移植物抗宿主病(Graft-versus-host-disease,GVHD)及造血重建不良依旧是限制进一步提高allo-HSCT疗效的瓶颈。

王健民(1957年-)，第二军医大学附属长海医院血液内科主任医师，教授，博士生导师，全军血液病研究所所长。1983年毕业于第二军医大学军医系。主要从事白血病诊治、造血干细胞移植临床及应用基础研究。曾兼任解放军血液病专业委员会主任委员、上海市医学会血液学分会主任委员、中华医学会血液学分会副主任委员、中国抗癌协会血液肿瘤专委会副主任委员、中华血液学杂志副主编和解放军医学杂志副主编等。曾承担国家自然科学基金重大、重点、面上项目，及“863”重大项目子课题、上海市科委重大、攻关项目等课题，曾获上海市医学科技一、二等奖、上海市科技进步一等奖、军队医疗成果一、二等奖、军队科技进步二等奖，军队院校育才金奖、银奖。在包括Blood、中华医学杂志、中华血液学杂志等国内外学术期刊发表论文(第一/通讯作者论文)约150篇,主编、副主编专著3部，参编专著10余部。

Allo-HSCT 治疗白血病的重要机制之一，是供体免疫细胞识别白血病细胞表面抗原进行相应的免疫应答，攻击并清除宿主体内残留的白血病细胞，即移植物抗白血病效应(Graft-versus-leukemia,GVL)，这一效应与供体免疫细胞攻击宿主携带主要组织相容性抗原的组织器官所致的移植物抗宿主反应(Graft-versus-host reactivity,GVHR)有密切关系，GVHR 严重时将损伤正常组织器官，导致GVHD。供体来源的正常造血重建不良，发生严重的血小板减少和贫血，是移植相关死亡(Transplatation related motality,TRM)的重要原因之一，与GVHD有一定关系。而移植后白血病复发，提示白血病及其干细胞(Leukemia stem cell,LSC)的生物学特性发生了重要改变和/或供体免疫细胞失能，不能有效攻击白血病(干)细胞，造成移植后GVL效应下降，即免疫逃逸。越来越多的研究提示，移植后骨髓局部免疫微环境重建情况对于造血功能重建和GVL效应发挥了重要作用。

众多研究者的临床实践提示，移植后的免疫重建对患者造血重建、平衡GVHD 和GVL效应起至关重要的作用，并对患者的临床结局产生关键影响，在allo-HSCT中处于核心环节[1,2]。临床研究还表明，急性GVHD 伴有血小板持续恢复不良的患者预后极差，提示移植后免疫微环境重建是一个精细调节的过程，既可以通过同种异基因反应诱发GVHD和GVL，也可以在发生GVHD 的同时出现疾病复发，还与造血功能重建有密切关系。移植后免疫重建的过程及其对 GVHD 和 GVL 的影响，已经有众多学者的大量研究。但这些研究主要是通过外周血各淋巴细胞亚群在细胞水平和分子水平的变化来描述的。骨髓作为造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)生长发育和白血病及LSC发生发展的主要场所，依赖于骨髓局部的造血微环境(niche);骨髓同时又是一级和二级免疫器官，淋巴细胞等免疫细胞起源于 HSC，反过来又是造血微环境的有机组成部分；这些免疫细胞及其分泌的细胞因子形成“免疫微环境”(immune niche)，是架构在造血微环境物理结构之上的局部免疫微环境，参与造血重建、免疫重建、GVHD 和 GVL效应。种种现象表明，骨髓免疫微环境的重建及其平衡可能是决定 GVHD 和 GVL 消长和强度的核心，而针对骨髓免疫微环境的重建过程和规律及其与造血微环境、HSC 和 LSC 相互作用的研究尚不多。如何通过调节骨髓免疫微环境，最大限度保留 GVL效应、减轻GVHD，同时保持 HSC 向各系血细胞均衡分化发育，重建造血功能，是allo-HSCT 移植免疫学关注的焦点问题。同时，allo-HSCT条件下造血和免疫重建的过程，也提供了人体的免疫微环境组成、发育及其与干细胞相互关系的绝佳研究模型。

本文综述近年来allo-HSCT后骨髓局部免疫微环境重建及其对造血重建和移植免疫反应调节的研究，为探讨移植后造血恢复、白血病复发与移植后移植免疫反应(GVHD和GVL)以及骨髓免疫微环境重建的关系，提高移植疗效提供一些线索。

1　Allo-HSCT 后的免疫重建(免疫微环境)

1.1正常和病理状态下，骨髓免疫微环境和造血微环境密切相关正常造血稳态的维持有赖于造血微环境。造血微环境是由一群组织细胞和细胞外基质构成的，通过细胞间接触和信号分子的作用维持和调控 HSC的局部组织微环境，其功能单元称为“龛”(niche)。目前的主流观点认为 ，骨髓造血微环境按解剖位置，可分为骨内膜微环境和血管微环境，前者主要由成骨细胞、破骨细胞等组成，后者主要由血管内皮细胞、富含CXCL12 的网状细胞组成。其他niche 细胞包括巢蛋白(Nestin+)间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、巨噬细胞、无髓鞘Schwann 细胞等。造血细胞本身也可以作为微环境的一部分，如巨核细胞[3]。如前所述，骨髓同时也是一级和二级免疫器官，有多种免疫细胞，包括T、B 和NK 淋巴细胞、树突状细胞，这些细胞与其分泌的细胞因子和介导的信号通路组成“免疫微环境”(immune niche)。生理状态下，骨髓中的T 淋巴细胞定植于靠近血窦的骨髓区域，参与了造血微环境的形成[4]。骨髓中的CD4+和CD8+淋巴细胞均具有记忆 T 细胞表型，能分泌HSC所必需的细胞因子，包括IL-3 以及GM-CSF 等。免疫细胞及其所分泌的细胞因子通过直接或者间接的途径参与调控HSC的增殖和分化。

免疫细胞为调节HSC的稳态以及病理状态下的增殖、分化提供免疫屏障。研究已经证实，供体CD3+CD4+T淋巴细胞有助于HSC的植入，而去T细胞移植物植入失败率显著增高。Treg抑制造血干/祖细胞的髓系分化，并且为造血干/祖细胞提供免疫豁免环境，使造血干/祖细胞免受免疫攻击[5]。除了适应性免疫外，固有免疫也参与了免疫微环境的组成。CD169+巨噬细胞分泌可溶性因子刺激Nestin+MSC 表达CXCL12，促进干细胞的归巢[6]。我们和其他研究者的研究都发现，白血病、移植后急性GVHD以及严重感染宿主体内的微环境改变有相似之处，都可以引起正常HSC的分化障碍[7-9]。白血病细胞及LSC与骨髓中的免疫细胞相互作用，后者会针对白血病细胞表面的抗原进行相应的免疫应答，识别和清除LSC。但实际上，白血病发生时骨髓免疫系统做出的应答类似于细菌感染，免疫系统倾向于保护HSC，但这样的免疫应答也可能保护LSC，甚至有助于LSC的扩增，促进白血病的进展。而白血病细胞甚至可以诱导生成白血病微环境，有利于LSC和白血病细胞的增殖[10]。因此，免疫微环境与HSC和LSC之间的相互作用复杂。白血病宿主中骨髓免疫微环境的成分和功能发生变化，LSC逃逸了免疫监视，进入无序增殖，而HSC被限制在细胞周期G0期，抑制了其向下分化的能力或出现分化偏倚，导致一系或多系造血功能障碍。进一步研究白血病宿主中构建于造血微环境物理结构之上的免疫微环境的成分和功能的变化，有利于采取干预措施诱导免疫系统保护HSC的正常增殖和分化，清除LSC，这可能是未来急性白血病新策略的方向之一。

1.2Allo-HSCT后的免疫微环境重建研究现状清髓性allo-HSCT通过致死剂量放化疗，清除宿主体内的免疫系统和造血系统，并通过植入的宿主免疫细胞(主要是T细胞)和HSC(可向下分化为免疫细胞)进行免疫重建。在allo-HSCT时为了预防GVHD发生，会对移植物做T细胞体外剔除或应用大量免疫抑制剂体内去除T细胞，均在一定程度上导致免疫重建延迟。如前所述，骨髓是造血器官，也是Ⅰ、Ⅱ级免疫器官，是HSC的主要栖身地和免疫细胞分化发育(特别是B淋巴细胞)的主要场所。目前国内外对于移植后免疫重建的研究更多地集中于外周血免疫细胞(如T细胞、B细胞和NK细胞)以及特定细胞亚群和T细胞亚克隆及免疫分子的动态变化[11-16]。对于引起这些变化的根本原因，即骨髓免疫微环境的变化以及供体HSC在骨髓微环境中分化出新的供体来源的免疫细胞的过程及其对造血重建以及LSC的影响和作用，仍然知之不多。众所周知，allo-HSCT后相当长时间内出现CD4/CD8比例倒置，对移植后GVHD和GVL平衡有重要影响，但其对围移植期感染以及对LSC/HSC究竟会产生什么样的影响，仍有待进一步的研究阐明。

2　骨髓免疫微环境对移植后正常HSC(正常造血)的影响

目前国内外对于allo-HSCT后供体HSC植入、分化和骨髓免疫微环境的关系研究不多。我们应用半相合小鼠骨髓移植合并急性GVHD(aGVHD)模型研究表明，供体来源HSC更多地处于静息状态，分化受到阻滞，主要发生在髓系共同祖细胞(CMP)向巨核/红系祖细胞(MEP)分化阶段[8]，这一结果在不同的小鼠移植模型中均得到了证实。这与临床观察到的aGVHD患者出现持续性血小板减少，巨核细胞植入不良有很强的一致性。使用对免疫有显著抑制作用的环孢素A，对改善巨核细胞植入有一定帮助，提示骨髓免疫微环境对移植患者的造血重建，尤其是CMP向MEP分化可能起了至关重要的作用。然而，环孢素A通过钙调蛋白进行免疫调节，作用靶点多，在移植后免疫重建的过程中，免疫微环境如何调控HSC分化，落脚在哪些靶点，可否进行有效的靶向干预?有待进一步深入研究。

3　异基因移植后骨髓免疫微环境重建对LSC(移植后复发)的影响

3.1白血病(干)细胞功能的主动改变有助于免疫逃逸近年来有学者提出，移植后供体免疫效应细胞通过识别宿主体内常规治疗无法杀伤的LSC，产生移植物抗LSC(GVLSC)作用，靶向性清除LSC，可达到治愈白血病的目的。然而，即使在致死剂量放化疗移植预处理和强大的GVL效应免疫攻击的双重作用下，白血病细胞或 LSC 仍可发生免疫逃逸，得以“潜伏”并最终导致白血病复发。目前认为，肿瘤免疫逃逸机制包括MHC、共刺激分子及黏附分子表达异常，导致T细胞失能、肿瘤抗原加工和提呈障碍，肿瘤细胞分泌免疫抑制因子或激活免疫抑制细胞，以及诱导免疫细胞凋亡等[17-19]。然而，这些免疫逃逸机制的假说大多数来源于实体肿瘤研究。白血病作为一种全身性疾病，其逃逸宿主免疫反应的模式与实体瘤可能有很大不同。Vago等[20]报道了17 例行半相合HSCT后复发的AML/MDS 患者，对复发时的白血病细胞进行突变检查发现，其中5例患者白血病细胞上与供体不匹配的HLA 位点消失，提示突变导致白血病细胞表面MHC分子缺失，使供体T淋巴细胞无法识别白血病细胞，是HSCT后白血病(干)细胞免疫逃逸的重要机制。因此，白血病(干)细胞本身功能特点的主动改变有助于逃逸免疫效应细胞的杀伤作用。

3.2骨髓免疫微环境中T 细胞功能受抑，有助于LSC 的免疫逃逸HSCT后T细胞亚群数量和功能改变以及表面共刺激分子等免疫分子表达和功能的变化与白血病细胞和LSC免疫逃逸机制之间的关系，是移植免疫研究的重要课题。我们前期在白血病小鼠模型中的研究表明，沉默共刺激分子ICOSL的表达，能够显著增强移植后的GVL，促进效应T细胞对白血病细胞的杀伤，延长荷瘤小鼠的生存时间。其机制可能是，阻断ICOSL 通路抑制Th2细胞反应，增强Th1细胞的免疫效应，进而促进了特异的抗肿瘤免疫效应[2，21]。T细胞表面抑制性共刺激分子CTLA-4和PD-1的高表达，将启动胞内内源性信号、抑制T 细胞活化和抗肿瘤作用，已经证实是实体瘤免疫逃逸中的重要机制之一[22，23]。AML中阻断CTLA-4 通路使得AML特异性T细胞显著扩增，对表达B7-1的AML细胞株具有显著杀伤作用。Zhang 等发现PD-1缺陷小鼠或者野生小鼠采用PD-1抗体阻断预处理时，AML抗原特异性T 细胞反应和存活率显著增高。免疫相关分子和信号通路，如ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3 和TIM-3 等，在HSCT 后AML 复发过程中的作用及其与LSC 和白血病复发的关系如何？靶向这些分子能否影响LSC/白血病细胞的免疫逃逸和复发？需要进一步的深入探讨。

综上所述，本文分别从骨髓免疫微环境的生理功能和在疾病模型中的作用，以及从allo-HSCT后骨髓局部免疫微环境对干细胞的免疫监视，包括LSC和正常HSC的角度，综述了近年来关于免疫微环境与造血干细胞移植术后造血重建以及疾病复发之间的重要关联。但是存在的问题远远多于我们已知的规律。目前的研究主要着眼于allo-HSCT后免疫大环境的改变，对于骨髓局部免疫微环境与HSC及LSC相互关系的研究尚待深入。若能回答这些问题，将有助于更深入地研究allo-HSCT后骨髓局部免疫微环境重建规律及其对疾病转归的影响，并可能通过调控骨髓免疫微环境，为移植后造血重建、免疫重建、复发和并发症防治提供新的策略。

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[收稿2016-04-24]

(编辑张晓舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.09.001

R551.3

A

1000-484X(2016)09-1249-04

①本文为国家自然科学基金(81530047、81470321、81270638、81090413)项目。