冠脉搭桥术患者心外膜、胸腔内脂肪组织中瘦素、基质金属蛋白-9的表达及临床意义

董晓龙，屈颖聪，周东东，陈新涛

(焦作市人民医院，河南焦作454002)



·临床研究·

冠脉搭桥术患者心外膜、胸腔内脂肪组织中瘦素、基质金属蛋白-9的表达及临床意义

董晓龙，屈颖聪，周东东，陈新涛

(焦作市人民医院，河南焦作454002)

目的探讨行冠脉搭桥术(CABG)患者心外膜、胸腔内脂肪组织中瘦素(Leptin)、基质金属蛋白-9(MMP-9)的表达及临床意义。方法 选取择期行CABG治疗的冠心病患者81例， 其中正性血管重构48例，负性血管重构或无血管重构33例。术中从前室间沟留取心外膜脂肪组织(EAT)，从心包外留取胸腔内脂肪组织(TAT)，分别采用免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测EAT、TAT中Leptin、MMP-9蛋白及基因表达。结果 EAT Leptin和MMP-9蛋白阳性表达率均高于TAT，EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量均高于TAT，两种组织Leptin、MMP-9蛋白及基因表达差异均有统计学意义(P均<0.05)；正性重构患者EAT中Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量均高于负性或无重构患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 行CABG治疗的冠心病患者EAT中Leptin和MMP-9表达增多，且二者表达与血管正性重构有关。

冠脉搭桥术；心外膜脂肪组织；瘦素；基质金属蛋白-9；血管重构

研究表明，脂肪组织不仅与能量代谢有关，而且可分泌瘦素(Leptin)、基质金属蛋白-9(MMP-9)等多种脂肪因子参与炎症或免疫反应[1]。心外膜脂肪组织(EAT)作为心肌表面脂肪组织具有分泌活性，可通过旁分泌参与动脉粥样硬化形成及进展[2]。有研究指出，EAT密度与冠状动脉粥样硬化斑块形成及性质密切相关[3]。本研究检测EAT中Leptin和MMP-9表达，并与胸腔内脂肪组织(TAT)中Leptin和MMP-9表达进行比较，探讨其在冠状动脉粥样硬化斑块形成中的意义以及与斑块稳定性的关系。

1　 资料与方法

1.1临床资料2014年2月～2015年8月本院择期行冠脉搭桥术(CABG)治疗的冠心病患者81例，男47例、女34例，年龄38～74(56.1±11.7)岁，冠心病病史1～8年、平均(4.2±1.7)年。根据美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级标准：Ⅱ级22例，Ⅲ级41例，Ⅳ级18例。术前血管内超声成像系统检测示血管负性或无重构(重构指数≤1.05)33例、正性重构(重构指数>1.05)48例。81例中，排除中重度瓣膜反流或狭窄者、左心室射血分数低于50%者、恶性肿瘤患者、肝肾功能不全者、甲状腺疾病者以及CABG禁忌证患者。本研究通过医院伦理委员会批准，患者对该研究均知情同意。

1.2EAT和TAT获取患者均在全麻体外循环下行CABG，术中从前室间沟留取EAT约1 g，同时从心包外留取TAT约1 g。取出后分成2份，1份迅速置于液氮中保存以备检，另一份浸泡于4%甲醛溶液中以供免疫组化检测。

1.3EAT、TAT Leptin、MMP-9蛋白表达检测采用免疫组织化学染色法。将甲醛固定组织标本常规石蜡包埋，连续进行切片，利用EnVision二步法分别进行Leptin和MMP-9组织化学染色。兔抗人Leptin和MMP-9多克隆抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供，免疫组织化学检测试剂盒由美国Zymed 公司提供。组织切片行HE染色后，分别由两位具有主治医师职称以上的病理科医师独立阅片。结果判定：细胞Leptin蛋白阳性表达为细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒状物质，MMP-9蛋白阳性表达为细胞核或细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒状物质。每张切片观察5个高倍视野进行阳性细胞计数，计算阳性细胞比例。阳性细胞比例<10%为阴性(-)，10%～25%为弱阳性(+)、26%～75%为阳性(++)、>75%为强阳性(+++)。

1.4 EAT、TAT中Leptin、MMP-9 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。分别取EAT或TAT 50 mg，用匀浆器进行处理后，利用Trizol总RNA提取试剂盒(购自上海生工生物公司)对组织中总RNA进行提取，纯化后检测纯度，取A260/A280>1.80样品完成后续实验。利用逆转录试剂盒(购自美国Invitrogen公司)进行逆转录获得第一模板链cDNA，以cDNA为模板使用PCR试剂盒(购自美国Invitrogen公司)完成PCR。Leptin、MMP-9和内参引物均由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。Leptin引物：上游5′-GATGACACCAAAACCCTCATC-3′，下游5′-GCCACCACCTCTGTGGAGTAG-3′； MMP-9引物：上游5′-CACCAAACTGGATGACGATG-3′，下游5′-GATGCGTGGAGAGTCGAATC-3′；β-actin引物：上游5′-CCGGGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游5′-TGCTGTCGCCTTCACCGTTC-3′。PCR反应条件：95 ℃、60 s，92 ℃、30 s，56 ℃、25 s，74 ℃、25 s，连续进行38个循环，每个样品均设置三个平行反应复孔。用2-△△Ct法获得EAT和TAT中Leptin mRNA、MMP-9 mRNA表达量。

2　结果

2.1EAT和TAT Leptin、MMP-9蛋白表达EAT Leptin和MMP-9蛋白阳性表达率均高于TAT，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1　 EAT和TAT Leptin和MMP-9蛋白表达比较[例(%)]

2.2EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表达EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量均高于TAT，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2　EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表达比较

2.3不同血管重构患者EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表达 正性重构患者EAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量均高于负性或无重构患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)；正性重构患者TAT Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量与负性或无重构患者无差异(P>0.05)。见表3。

表3　　　　不同血管重构患者EAT和TAT Leptin、MMP-9基因表达比较

3　讨论

冠状动脉粥样硬化是冠心病发生的主要原因，冠状动脉粥样硬化斑块性质与患者病情及预后密切相关[4]。EAT作为与冠状动脉距离最近的脂肪组织，越来越多的研究表明，冠状动脉粥样硬化早期血管壁内皮破坏及内膜增厚与EAT有关[5～7]。亦有研究指出，EAT可分泌炎性因子而参与动脉粥样硬化的发生及进展[8]。Leptin是EAT产生的炎性因子之一，可通过旁分泌而加速易损斑块中血管生成，而新生血管又可使斑块体积进一步增大，斑块内炎症细胞及脂质进一步增多[9]。MMP-9作为促进细胞外基质降解的主要因子，亦可加速血管中层弹力膜及斑块纤维帽降解，从而加速斑块易损性及血管正性重构[10]。本研究中免疫组化和实时荧光定量PCR检测结果均显示，EAT Leptin和MMP-9蛋白阳性表达率和基因表达量均高于TAT，说明EAT可大量产生Leptin和MMP-9，可能参与了冠心病冠状动脉粥样硬化病程进展。

研究表明，血管重构与冠状动脉粥样硬化斑块性质密切相关[11]。有研究指出，动脉粥样硬化血管出现正性重构时，炎性细胞数量显著增加、MMP分泌增多，而血管平滑肌减少、胶原分解增多，使动脉粥样硬化斑块稳定性降低，易发生破裂[12]。影像学检查结果亦显示，正性重构是不稳定型心绞痛的主要类型，斑块性质主要为脂质性斑块，而负性重构或无重构则是稳定型斑块主要类型，斑块性质主要为钙化或纤维斑块[13,14]。本研究显示，正性重构患者EAT中Leptin mRNA和MMP-9 mRNA表达量均高于负性或无重构患者，而TAT中两者无差异，说明EAT中Leptin、MMP-9表达增加与正性重构有关。分析其原因可能为：Leptin可加速血管生成，从而使粥样斑块中滋养血管密度增加；同时，亦可促使组织组织中脂肪酸、甘油三酯分解，这些因素均可导致冠状动脉粥样硬化斑块易损性的发生[15]。MMP-9可通过作用于血管中层弹力膜及斑块纤维帽而直接参与血管重构，同时MMP-9亦可通过使细胞外基质降解协同Leptin促进血管新生[16]；两者共同作用加速了斑块的易损性。

综上所述，行CABG治疗的冠心病患者EAT中Leptin和MMP-9表达增多，Leptin和MMP-9共同参与了血管重构，与冠状动脉粥样硬化斑块易损性密切相关。

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