融合蛋白PTD4-SOD1对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

李鹏，陈丹丹，陈章强，杨文超，彭晓红

(华中科技大学附属普爱医院，武汉430000)



·基础研究·

融合蛋白PTD4-SOD1对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

李鹏，陈丹丹，陈章强，杨文超，彭晓红

(华中科技大学附属普爱医院，武汉430000)

目的观察融合蛋白转导结构域4(PTD4)- 超氧化物歧化酶1( SOD1)对心肌缺血再灌注损伤(I/R)大鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)水平的影响，并探讨其对心肌细胞的保护作用。方法 将雄性SD 大鼠40 只随机分为假手术组(S组)、I/R组、SOD1蛋白组(SOD1组)、PTD4-SOD1融合蛋白组(PTD4-SOD1组) 4组，每组10只。免疫荧光法检测PTD4-SOD1融合蛋白穿膜能力，比色法检测各组血清CK、LDH水平，TBA染色法检测各组血清MDA水平。结果 S组、I/R组、SOD1组均没有代表融合蛋白的红色荧光出现，PTD4-SOD1组出现红色荧光。与S 组比较，I/R 组、SOD1 组、PTD4-SOD1 组的CK、 LDH、MDA水平明显升高(P均<0.01)。与I/R 组、SOD1 组比较，PTD4-SOD1 组CK、 LDH、MDA水平降低(P均<0.01)。结论 PTD4-SOD1融合蛋白有较强的穿膜能力，转导进入细胞内部的SOD1仍保持其活性，能有效抑制脂质过氧化反应，降低血清CK、LDH、MDA水平，对心肌细胞有保护作用。

心肌缺血再灌注损伤；蛋白转导结构域；融合蛋白；肌酸激酶；乳酸脱氢酶；丙二醛；大鼠

蛋白转导结构域(PTD)是以肽为载体的转导系统，是一种能够将生理状态下不能进入细胞发挥生物学效应的物质带入细胞内的载体工具[1]。目前，国内外研究者将有穿膜能力的多肽结构引入到超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶或者其他目的蛋白的穿透细胞膜实验均显示多肽结构有很强的穿膜特性[2～6]。与其他PTD 相比，本研究所选用的是PTD4具有更加稳定的二级结构和更高的转运效率[7]。2015年8月～2016年4月，我们观察融合蛋白PTD4-SOD1 对心肌缺血再灌注(I/R)损伤模型大鼠血清肌酸激酶(CK) 、乳酸脱氢酶(LDH) 及丙二醛(MDA)的影响，以探讨融合蛋白PTD4-SOD1对心肌的保护作用。

1　材料与方法

1.1材料融合蛋白PTD4-SOD1、SOD1 蛋白(上海生物工程有限公司)；一抗兔抗His-probe(G-18)抗体 、二抗罗丹明荧光素标记的山羊抗兔抗体、一抗小鼠抗心肌TnT 抗体、二抗异硫氰酸标记的山羊抗小鼠抗体(美国Santa cruz biotechnology 公司)；大鼠肌酸激酶试剂盒、大鼠乳酸脱氢酶试剂盒 、大鼠丙二醛试剂盒(南京建成科技有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。雄性SD 大鼠40 只，体质量(330±20)g，由我院实验动物中心提供。

1.2动物分组及处理随机将大鼠分为4 组，每组10 只。假手术组(S 组)： 冠状动脉只穿线不结扎，30 min 后由尾静脉给予0.9%氯化钠注射液1 mL。I/R 组： 缺血30 min再灌注120 min，再灌注时由尾静脉给予0.9%氯化钠注射液1 mL。SOD1 蛋白组(SOD1 组) ：缺血30 min再灌注120 min，于再灌注时由尾静脉给予SOD1 蛋白500 μg(1 mL)。PTD4-SOD1 融合蛋白组 (PTD4-SOD1 组)：缺血30 min再灌注120 min，于再灌注时由尾静脉给予PTD4-SOD1 融合蛋白500 μg(1 mL)。

1.3动物模型制备常规术前准备，10%水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉后将大鼠仰卧位固定于手术台上。使用规格为18G的静脉留置针行气管插管术，接小动物呼吸机辅助呼吸(潮气量3 mL/100 g，频率60 次/min，呼吸比5∶3)，经右颈总动脉置管接压力换能器，使用BL-420 生物系统监测心电活动。于胸骨左侧0.5 cm 第三、四肋间隙处切皮，钝性分离肌肉，使用手术钳夹断左侧第三、第四肋骨，使用小型撑开器沿胸骨纵轴方向撑开胸骨，暴露心脏，适应性放置10 min；使用小镊子轻柔充分的撕开心包膜，适应性放置5 min，结扎左冠状动脉前降支(LAD)。观察心电监护波形变化，若ST 段抬高、T 波高耸、左心室变为苍白色为结扎成功标志。30 min 后，松解LAD 行再灌注；再灌注时心电监护示ST 段明显降低、T 波下降、左心室由苍白色变为暗红色为再灌注成功标志。

1.4血清CK 、LDH、MDA水平测定再灌注结束后，通过连有负压管的静脉采血针直接刺入左心室采血5 mL，经高温低速离心机离心(4 000 r/min，8 min)，用移液器吸取上清液，存于1.5 mL的EP 管中，置于-20 ℃冰箱。严格按照试剂盒说明书采用比色法、TBA染色法检测血清CK 、LDH 及MDA水平。

1.5心肌染色及融合蛋白穿膜能力检测采血液完毕后，使用眼科剪从主动脉根部快速剪断，使用0.9%氯化钠注射液经主动脉冲洗心腔，冲洗干净以备后用。心肌染色采用TTC 染色法，严格按照试剂盒说明书进行。PTD4-SOD1融合蛋白穿膜能力检测采用免疫荧光法。

2　结果

2.1大鼠心肌染色及免疫荧光检测情况S组大鼠无心肌缺血坏死，心肌TTC 染色为红色；其他三组大鼠缺血梗死区TTC 染色为苍白色，说明LAD 结扎成功。S组、I/R组、SOD1组均没有代表融合蛋白的红色荧光出现，PTD4-SOD1组出现红色荧光。

2.2四组血清CK 、LDH、MDA水平比较与S 组比较，I/R 组、SOD1 组、PTD4-SOD1 组的CK、 LDH、MDA水平明显升高(P均<0.01)。与I/R 组、SOD1 组比较，PTD4-SOD1 组CK、 LDH、MDA水平降低(P均<0.01)。见表1。

表1　四组血清CK 、LDH、MDA水平比较

注：与S 组比较，*P<0.01；与I/R 组、SOD1 组比较，△P<0.01。

3　讨论

虽然PTD 转导技术仍处于探索的早期阶段，但作为一种新兴技术，它不仅用于肿瘤的基因治疗，还用于携带目的蛋白进入细胞内部起到治疗氧化应激相关疾病的作用。融合蛋白穿透细胞膜进入细胞内部是其对缺血再灌注损伤心肌发挥保护作用的基础。本研究中PTD4-SOD1 组在荧光显微镜下显示代表融合蛋白的红色荧光与蓝色荧光及绿色荧光重合，表示融合蛋白成功穿透细胞膜进入细胞内部，并在细胞质内散在分布。SOD1 组仅出现蓝色荧光和绿色荧光，而没有红色荧光，说明没有PTD4 结构的SOD1 无法进入细胞内。

在I/R发生发展的多种可能机制中，氧自由基机制最为重要。氧自由基增加的主要原因是线粒体氧化磷酸化障碍和中性粒细胞呼吸爆发。在心脏再灌注过程中，缺血过程产生的黄嘌呤氧化酶被认为与活性氧(ROS)产生有关。ROS 能引起线粒体通透性转换孔开放，并且引起细胞核和胞质成分损伤，导致产生线粒体内部自由基释放的正反馈反应，加剧了对细胞的损伤[8～10]。因此，有效清除I/R过程中产生的ROS至关重要。机体通过酶系统和非酶系统产生ROS，ROS 能够攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，并形成脂质过氧化物，如MDA、羟基、酮基、羰基、内过氧基和氢过氧基。初始的一个ROS 便能导致很多脂类分解产物的形成，这些产物中，部分会导致细胞代谢及功能障碍，甚至是死亡。心肌组织缺血再灌注后，大量产生的ROS 引发的脂质过氧化作用是再灌注损伤的首要原因。心肌缺血再灌注同时也改变了ROS产生和ROS 消除之间的动态平衡，即心肌缺血再灌注时，ROS严重增多，ROS 清除剂SOD 减少。

CK 是心肌缺血受损时血清酶中升高最早的一种酶，其释放量是衡量心肌损害程度的重要标志[11～13]。LDH存在于所有组织细胞的细胞质中，在急性心肌梗死发生初期，LDH 呈显著性升高。目前，I/R过程中LDH 的升高主要认为是由于ROS 的堆积和Ca2+超载两大因素引起。有研究者发现，在心肌细胞缺血缺氧时，ROS 清除系统的功能将会降低甚至丧失;一旦恢复血供和氧供后，ROS 便爆发性产生并急剧堆积，破坏膜结构完整性，Ca2+通透性增加，造成细胞慢性或急性损伤，细胞内LDH 大量外流入血。因此，血清中LDH 的升高程度可以用来作为细胞损伤的判断指标。本研究通过PTD 技术将ROS 清除剂SOD1 转导入细胞内部，观察I/R损伤大鼠血清CK、LDH、MDA 水平变化，以确定融合蛋白对心肌的保护作用。结果显示，PTD4 能够将外源性的SOD1 转导入细胞内部，增强了心肌ROS 清除系统清除ROS的能力，降低I/R时ROS 的产生，抑制ROS 引起的脂质过氧化反应，实现了对心肌细胞的保护作用。

本研究虽已证实融合蛋白PTD4-SOD1在动物模型中穿膜后仍保持高效活性，但未对融合蛋白处理前后心功能进行测定；且融合蛋白不具靶向性，选择合适的注射途经也是至关重要的。若能对以上指标及注射途径的选择进行完善，进一步充实融合蛋白的心肌保护证据，则本研究内容更具临床意义。

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湖北省卫计委科研基金资助项目(WJ2015MB154)。

杨文超(E-mail: eyhyg@sina.com )

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.009

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0028-03

2016-03-06)