薏苡仁油的质量分析

郑　利，陈　丹，范世明，廖淑彬，黄　娇，谢　平



薏苡仁油的质量分析

郑利，陈丹，范世明，廖淑彬，黄娇，谢平

目的建立薏苡仁油的总酯量测定和薄层色谱鉴别以及气相色谱含量测定法。方法采用容量滴定法测定薏苡仁油的总酯量；采用薄层色谱法鉴别薏苡仁油中的特征成分；采用气相色谱法，经油酸和亚油酸经衍生化处理，以水杨酸甲酯为内标物按内标法计算油酸及亚油酸含量。结果薏苡仁油中总酯量以甘油三酯计，均不低于95%；薄层色谱鉴别斑点清晰，专属性强；气相色谱法定量分析油酸甲酯在0.054 4～1.087 2 mg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为97.92%(RSD=1.24%，n=6)，亚油酸甲酯在0.041 5～1.050 8 mg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.4%(RSD=2.23%，n=6)，3批薏苡仁油中油酸含量分别为59.59%,58.29%和58.67%，亚油酸含量分别为25.17%,24.31%和24.77%。结论建立的薏苡仁油总酯量测定法、薄层色谱鉴别法及气相色谱(内标法)含量测定方法操作简便，结果准确，可有效用于薏苡仁油的质量控制。

薏苡属；甘油三酯类；色谱法，气相；油酸；亚油酸；质量控制

薏苡仁是禾本科植物薏苡[Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman.) Stapf]的成熟种仁，具有健脾、补肺、清热、利湿的功效[1-2]。薏苡仁油是从薏苡仁通过超临界CO2萃取等技术所获得，主要含有油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸等成分，其中油酸与亚油酸含量较高，为主要活性成分，且是其易氧化的特征代表性成分[3]；薏苡仁油含甘油三酯达87%以上，其中主要成分有甘油三油酸酯、甘油三亚油酸酯等[4-6]。现代药理学研究证明，薏苡仁油具有明显的抗肿瘤作用，临床上已被用作抗肿瘤辅助治疗药物。但薏苡仁油易氧化，具有不稳定性[7-8]。为有效控制薏苡仁油的质量，使其适用于后续制剂研究的原料，本研究拟建立薏苡仁油中的总酯量测定法及薄层色谱鉴别法，研究样品衍生化前处理，建立衍生化气相色谱法(内标法)测定薏苡仁油中特征成分油酸、亚油酸含量，为薏苡仁油从整体到特征成分的质量控制以及进一步深入开发薏苡仁油制剂提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器气相色谱仪及氢火焰离子化检测器(Agilent 6890N，美国安捷伦科技公司)。

1.1.2试药甘油三油酸酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111692-201002，含量99.7%)；薏苡仁油对照品(中国食品药品检定研究院，批号:111750-201102)；亚油酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111622-201203)；油酸甲酯(美国Fluka公司，供含量测定)；亚油酸甲酯(中国食品药品检定研究院，批号：111625-200502，供含量测定)；水杨酸甲酯[阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号：29412，分析标准品，含量≥99.5%]；薏苡仁油(自制，委托广州合诚三先生物有限公司加工[9])；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1薏苡仁油含总酯量的测定精密称取薏苡仁油约1.3 g，置250 mL锥形瓶中，精密加入乙醇制氢氧化钾滴定液(0.5 mol/L)25 mL，加热回流30 min，用乙醇10 mL冲洗冷凝管，放冷，加酚酞指示液1 mL，用盐酸滴定液(0.5 mol/L)滴定至溶液粉红色褪去，加热至煮沸，如溶液又呈粉红色，再继续滴定至粉红色褪去，同时做空白实验。

1.2.2薏苡仁油的薄层色谱鉴别取薏苡仁油0.1 g，加2 mL石油醚(60～90 ℃)使溶解，作为薏苡仁油供试品溶液。另取亚油酸对照品、甘油三油酸酯对照品、薏苡仁油对照品适量，分别加石油醚制成每1 mL含亚油酸21.75 mg、甘油三油酸酯40.48 mg和薏苡仁油40.75 mg的溶液，作为各对照品溶液；分别取甘油三油酸酯对照品39.9 mg、亚油酸对照品40.6 mg，加石油醚2 mL使其溶解，制成每1 mL含甘油三油酸酯19.95 mg、亚油酸20.30 mg的混合对照品溶液。按照薄层色谱法《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B试验，分别吸取对照品溶液、供试品溶液各2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(25∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5%香草醛-硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热约5 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.3薏苡仁油中油酸与亚油酸的GC含量测定

1.2.3.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱 Agilent DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气N21.0 mL/min，空气流量300 mL/min，氢气流量30 mL/min，尾吹气流量45 mL/min；检测器FID，检测器温度250 ℃；进样口温度220 ℃；进样量1 μL，分流进样，分流比30∶1；柱温190 ℃。

1.2.3.2对照品溶液的制备精密称取油酸甲酯对照品27.18 mg，亚油酸甲酯对照品20.77 mg，分别用氯仿制成每1 mL含5.436 0 mg油酯甲酯、4.154 0 mg亚油酯甲酯的对照品溶液，即得。

1.2.3.3内标溶液的制备精密称取水杨酸甲酯对照品128.52 mg，用氯仿制成每1 mL含5.140 8 mg水杨酸甲酯的内标溶液，即得。

1.2.3.4供试品溶液的制备取薏苡仁油50 mg，置50 mL圆底烧瓶中，加0.05% 2,6-二叔丁基对甲酚的四氢呋喃溶液1 mL，使其溶解，加5%(W/V)氯化氢甲醇溶液2 mL，在80 ℃水浴中回流2.5 h，放冷，移入20 mL具塞试管中，用5%氯化钠溶液5 mL分次洗涤圆底烧瓶，洗涤液并入具塞试管中，用5 mL正己烷振摇萃取，正己烷层移入盛有2%碳酸氢钾溶液4 mL的另一具塞试管中，振摇，分取正己烷层，水层再用正己烷萃提2次，每次5 mL，合并正己烷提取液，置50 mL圆底烧瓶中，在60 ℃水浴中减压浓缩至干，残渣用氯仿溶解并定量转移至5 mL量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.3.5专属性试验分别取油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品溶液400 μL，置于5 mL量瓶，加入内标溶液500 μL，用氯仿稀释至刻度，作为混合对照品溶液。取供试品溶液700 μL，置于5 mL量瓶，加入内标溶液500 μL，用氯仿稀释至刻度，作为含内标供试品溶液。取空白溶剂、混合对照品溶液、含内标供试品溶液各1 μL，分别按“1.2.3.1”项下色谱条件测定。

1.2.3.6定量限考察取对照品溶液按一定稀释倍数逐级稀释，直至在“1.2.3.1”项色谱条件下能定量检测出油酸甲酯与亚油酸甲酯量作为其最低定量限(S/N>10)。

1.2.3.7标准曲线的制备与线性关系考察精密吸取对照品溶液各50,100,200,400,800,1 000 μL，置于5 mL量瓶，分别加入内标溶液500 μL，用氯仿稀释至刻度，得系列混合对照品溶液。分别吸取系列混合对照品溶液1 μL，注入气相色谱仪，测定，以对照品与内标物的峰面积比(A对照品/A内标)为纵坐标，对照品的浓度(C对照品)为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.8精密度试验取同一混合对照品溶液，连续进样6次，以对照品与内标物的峰面积比(A对照品/A内标)计算RSD，评价精密度。

1.2.3.9稳定性试验精密称取薏苡仁油51.60 mg，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”项同法操作，制成含内标供试品溶液，4 ℃下放置，分别在0，2，4，6，8，12和24 h测定并计算油酸与亚油酸RSD值。

1.2.3.10重复性试验分别取6份同一批薏苡仁油各约50 mg，精密称定，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”项同法操作，测定，分别计算油酸、亚油酸的含量及其RSD值。

1.2.3.11加样回收率试验分别精密称取6份已测含量的同一批薏苡仁油样品(油酸含量为59.59%，亚油酸含量为25.17%)约25 mg，精密加入油酸甲酯及亚油酸甲酯对照品溶液，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”项同法操作，测定，计算回收率。

1.2.3.12样品测定分别称取6份3批薏苡仁油约50 mg，每批3份，精密称定，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”项下同法操作，测定薏苡仁油中油酸与亚油酸的含量，并根据分子量换算得到样品中所含的油酸及亚油酸的含量。换算公式如下：

2　结　果

2.1薏苡仁油含总酯量的测定采用滴定法测得3批薏苡仁油含总酯量以薏苡仁油甘油三酯计，分别为97.89%，97.02%和97.01%，RSD值为0.52%(n=3)。结果表明，3批薏苡仁油含酯量以薏苡仁油甘油三酯计，均不低于95%，符合规定。

2.2薏苡仁油的薄层色谱鉴别结果表明，供试品色谱中，在与亚油酸、甘油三油酸酯、薏苡仁油对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且方法重复性好(图1)。

2.3薏苡仁油中油酸与亚油酸的GC含量测定

2.3.1专属性试验油酸甲酯、亚油酸甲酯等色谱峰完全分离，分析时间<18 min(图2)。

2.3.2定量限考察油酸甲酯定量限浓度为5.436 μg/mL，亚油酸甲酯定量限浓度为4.154 μg/mL。

2.3.3标准曲线的制备与线性关系考察结果测得油酸甲酯回归方程为：

y=1.745 0 x-2.71×10-2，r=0.999 3

亚油酸甲酯回归方程为：

y=2.677 6 x-8.60×10-3，r=0.999 5

结果表明，油酯甲酯在0.054 4～1.087 2 mg/mL范围、亚油酸甲酯在0.041 5～1.030 8 mg/mL范围呈良好的线性关系。

2.3.4精密度试验A油酸甲酯/A水杨酸甲酯的RSD为0.36%，A亚油酸甲酯/A水杨酸甲酯的RSD为0.27%，表明符合精密度要求。

2.3.5稳定性试验油酸RSD为0.52%，亚油酸RSD为0.69%，提示供试品溶液放置于4 ℃时在24 h内稳定。

2.3.6重复性试验同一批薏苡仁油供试品油酸平均含量58.46%(RSD=1.05%，n=6)，亚油酸平均含量24.54%(RSD=2.12%，n=6)，说明含量测定方法重复性良好。

2.3.7加样回收率试验薏苡仁油中油酸与亚油酸的GC含量测定方法准确度良好，符合要求(表1)。

2.3.8样品测定运用建立的薏苡仁油中油酸与亚油酸的GC含量测定方法，测定3批样品中油酸与亚油酸含量，说明薏苡仁油中富含油酸、亚油酸(表2)。

表1　油酸甲酯和亚油酸甲酯回收率试验结果

表2　薏苡仁油中油酸、亚油酸含量测定结果

3　讨　论

在薄层色谱法分析中，实验采用硅胶G为固定相，曾分别比较石油醚-乙醚-冰醋酸(9∶1∶0.1)及石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶3∶0.1)的展开系统，结果供试品斑点分离效果较差，产生明显的拖尾；另外，曾采用聚酰胺薄膜为固定相，以石油醚-乙醚-冰醋酸(18∶2∶1)为展开剂，薄层展开后呈暗斑，难以检视，且方法重复性较差。经试验比较，结果选择硅胶G薄层板，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(25∶5∶1)为展开剂的TLC鉴别方法，且能较好显示薏苡仁油特征成分群。

在薏苡仁油的衍生化GC法分析中，曾先后比较采用非极性毛细管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和极性毛细管柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)对薏苡仁油中各脂肪酸组分的分离影响，结果非极性毛细管柱的分离效果较差，而极性毛细管柱DB-WAX在柱温190 ℃下，可将薏苡仁油中各组分分离，故选择极性毛细管柱DB-WAX对薏苡仁油中的油酸与亚油酸进行分析测定。同时，实验筛选了内标物正十五烷、三十二烷、水杨酸甲酯。其中，正十五烷、三十二烷在极性毛细管柱上，出峰太快，甚至与溶剂峰混合，而水杨酸甲酯与薏苡仁油中的脂肪酸组分达到良好分离，且峰形尖锐，故选择水杨酸甲酯作为内标物。

经薏苡仁油的GC分析提示，薏苡仁油中油酸、亚油酸为长碳链脂肪酸，沸点较高，难以直接采用GC法进行测定，故实验通过衍生化处理，先将薏苡仁油中的油酸、亚油酸甲酯化，降低其沸点，采用甲酯化后的脂肪酸甲酯标准物作为对照品，再以GC法测定，内标法定量计算脂肪酸甲酯含量，由此换算得到薏苡仁油中油酸与亚油酸的含量，该方法准确度、灵敏度良好，18 min即可完成一个样品的分析，为薏苡仁油的含量测定和质量控制提供了一个较为可行的分析方法。根据注射用薏苡仁油部颁标准(2001年版)测得薏苡仁油中油酸、亚油酸平均含量分别为51.65%及23.14%；运用本研究建立的GC内标法测得3批薏苡仁油中油酸、亚油酸平均含量分别为58.85%及24.75%，所得结果均符合注射用薏苡仁油部颁标准要求(油酸含量45%、亚油酸含量19%)规定。

[1]吴岩,原永芳.薏苡仁的化学成分和药理活性研究进展[J].华西药学杂志,2010,25(1)：111-113.

[2]胡少华,肖小年,易醒,等.薏苡仁的研究新进展[J].时珍国医国药,2009,20(5)：1059-1060.

[3]乐巍,邱蓉丽,吴德康,等.不同居群薏苡种仁脂肪酸成分的GC-MS分析[J].中药材,2008,31(11)：1613-1614.

[4]郑利,陈丹,范世明.不同产地薏苡仁的鉴别及含量测定[J].福建中医药大学学报,2012,22(5)：52,54.

[5]向智敏,祝明,陈碧莲,等.HPLC-MS分析薏苡仁油中的甘油三酯成分[J].中国中药杂志,2005,30(18)：1436-1438.

[6]郑利,陈丹,曾令军,等.UPLC-MS 测定不同产地薏苡仁中甘油三油酸酯的含量[J].中国现代应用药学,2014,31(2)：200-204.

[7]Xue M L,Feng X,Gang W,et al.Kanglaite injection plus chemotherapy versus chemotherapy alone for non-small cell lung cancer patients:A systematic reviewand meta-analysis[J].Current Therapeutic Research,2008,69(5)：381-411.

[8]Pei P,Yan W,Zhu Y G,et al.Antitumor activity and immunomodulatory effects of the intraperitoneal administration of Kanglaite in vivo in Lewis lung carcinoma[J].J Ethnopharmacology,2012,143(2)：680-685.

[9]国家药典委员会.国家药品标准新药转正标准第30册[S].北京：人民卫生出版社,2003：29.

(编辑:张慧茹)

Study on Quality Analysis of Coix Seed Oil

ZHENG Li,CHEN Dan,FAN Shiming,LIAO Shubin,HUANG Jiao,XIE Ping

Department of Pharmacy,Fujian University of TCM,Fuzhou 350122,China

ObjectiveTo study triglyceride content in the coix seed oil and to establish a qualitative and quantitative analysis method of coix seed oil.MethodsTitration was used to study triglyceride content in the coix seed oil.TLC was applied to identify the characteristic components in the coix seed oil.After derivatization,gas chromatography was used to determine the content of oleic acid and linoleic acid,through internal standard method with methyl salicylate as the internal standard substance.ResultsTotal esters content based on triglyceride content in the coix seed oil was not less than 95%.The qualitative identification with TLC was specific.Under the GC,methyl oleate had a good linearity in the range of 0.054 4～1.087 2 mg/mL,and the average recovery was 97.92% (RSD=1.24%,n=6).The methyl linoleate content was in the range of 0.041 5～1.050 8 mg/mL,while its average recovery was 100.4% (RSD=2.23%,n=6).In the 3 batches of coix seed oil,the content of oleic acid were 59.59%,58.29% and 58.67%; and the content of linoleic acid were 25.17%,24.31% and 24.77%.ConclusionThe established method for triglyceride content,TLC and GC are simple,accurate and reliable,which can be well used in quality control of coix seed oil.

coix；triglycerides；chromatography,gas；oleic acid；linoleic acid；quality control

2016-05-09

福建省科技计划重点项目(2014Y0062)；福建省科技计划项目(2010Y2004)

福建中医药大学 药学院，福州350122

郑利(1988-)，女，药师，医学硕士

陈丹.Email:13515026709@163.com

R194；R197；R273；R282.71；R73

A

1672-4194(2016)04-0222-05