胃动蛋白1在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义

林洁琼，林贤东，郑雄伟，胡　丹，陈　刚，应敏刚



胃动蛋白1在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义

林洁琼，林贤东，郑雄伟，胡丹，陈刚，应敏刚

目的研究EB病毒(EBV)感染与胃癌的相关性及胃动蛋白1(GKN1)表达与胃癌临床病理特征、EBV感染的关系，为EBV相关胃癌的治疗、控制和预防提供理论依据。方法胃腺癌患者104例，分析EBV感染与临床病理特征的关系。采用免疫组织化学方法检测GKN1在慢性胃炎组织、肠化胃黏膜、慢性胃溃疡组织、原位癌及胃癌组织中的表达情况；应用实时定量PCR检测胃癌及癌旁组织中GKN1 mRNA的表达水平与临床病理特征的关系。结果EBV感染与胃癌Lauren’s分型和年龄密切相关(P<0.05)，而与患者的性别、肿瘤部位、病理类型及TNM分期无显著相关性(P>0.05)。GKN1 mRNA在胃腺癌和癌旁组织中的表达水平差别具有统计学意义(P<0.05)，且GKN1 mRNA的低表达水平与肿瘤大小(P=0.012)、发生部位(P=0.022)及EBV感染(P=0.034)密切相关。结论GKN1可能是EBV相关胃癌潜在的肿瘤标志物。

疱疹病毒4型，人；胃肿瘤；肿瘤标记，生物学

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1]。我国属胃癌高发区域，每年约有40万新发胃癌患者，占世界总发病人数的42%，且新发胃癌患者呈年轻化趋势[2]。因此，胃癌对我国国民的生命健康构成严重威胁。胃癌的发生受感染、遗传、环境、精神和心理状态等多种因素的影响，其发生和发展是多因素、多阶段、多基因共同作用的结果[3]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染与胃癌的发生发展密切相关[4-5]，EBV相关胃癌(epstein-barrvirus-associated gastric carcinoma,EBVaGC)已逐渐被人们所了解和认知。然而，EBV感染与胃癌的关系尚不完全清楚。胃动蛋白1(gastrokine 1,GKN1)，又称CAI1、AMP-18、foveolin或TFIZ2，位于染色体2p13.3，全长约6 kb，含有6个外显子和5个内含子，是最新发现的表达于正常胃黏膜上皮的新型分泌蛋白，具有促进胃黏膜上皮细胞分裂和移行、维持胃黏膜完整和促进受损黏膜修复的功能[6]。Rui等研究结果表明，GKN1在胃癌组织和细胞系中表达明显下调，GKN1具有抑制胃癌细胞体外和体内的增殖能力[7]，提示GKN1可能成为胃癌的特异性标记物或胃癌生长的抑制因子。但GKN1与EBVaGC的关系尚不清楚。本研究旨在通过研究EBV感染与胃癌的相关性，以及GKN1表达与胃癌临床病理特征及EBV感染的关系，为EBVaGC的治疗、控制和预防提供理论依据。

1　对象与方法

1.1对象收集2012年1月-2015年4月确诊的胃癌根治标本104例，男性81例，女性23例，年龄中位数59岁(22～80岁)，其中<60岁57例，≥60岁47例。EBVaGC 41例，非EBVaGC 63例；非食管交界胃癌79例，食管交界胃癌25例；肠型胃癌33例，弥漫型胃癌71例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期73例。

1.2方法

1.2.1组织芯片蜡块制作使用10%中性福尔马林固定胃癌切除标本，石蜡包埋，采用组织芯片制作机细针打孔的方法，从众多的组织蜡块(供体蜡块)中采集数十至上百个圆柱形小组织(组织芯)，并将其整齐排列于另一空白蜡块(受体蜡块)中，制成组织芯片蜡块。

1.2.2EBV原位杂交检测将组织芯片蜡块进行切片，烤片至少2 h，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后滴加蛋白酶K消化约5 min，滴加EBV核酸探针(Epstein-Barr encoded RNA,EBER)杂交液，55 ℃恒温箱中孵育90 min，后调至37 ℃孵育过夜。滴加一抗孵育30 min，滴加二抗孵育20 min。洗涤擦干，滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)聚合物，反应30 min；擦干组织周围水分，滴加1∶50 DAB试剂，显色6 min，洗涤后用苏木精复染，自来水冲洗5 min，切片经梯度酒精脱水干燥后采用中性树胶封固，晾干后观察。

1.2.3免疫组织化学染色将组织芯片蜡块进行切片烤片后，采用高压锅抗原修复法；滴加GKN1一抗抗体(抗体浓度1∶1 600，美国Sigma公司)，4 ℃过夜；滴加二抗A试剂，37 ℃孵育2 h，滴加试剂B，DAB复合物显色后苏木精复染，自来水冲洗5 min，室温干燥后使用梯度乙醇脱水，采用中性树胶封片。阴性对照：以PBS代替一抗；阳性对照：已知GKN1阳性的正常胃黏膜组织。

1.2.4新鲜组织RNA提取并逆转录取30 mg新鲜胃癌及癌旁组织，在液氮环境下进行快速研磨，把组织匀浆转移到无RNA酶的EP管中，其余步骤严格按照Trizol法提取新鲜组织的总mRNA，采用紫外分光光度仪测定每份样本总RNA的OD260 nm/OD280 nm，以检测其纯度及浓度，同时进行1%琼脂凝胶电泳检测RNA的完整性。将稀释好的RNA逆转录成cDNA，操作严格按照逆转录试剂盒说明书进行。

1.2.5实时荧光定量PCR分析根据引物设计原则设计实时荧光定量PCR引物。

目的基因GKN1基因(PCR产物为205 bp)：

上游：5’-GCCTGATGTACTCAGTCAACC-3’

下游：5’-TAGTTCTCCACCGTGTCTCC-3’

管家基因β-actin基因(PCR产物为236 bp)：

上游：5’-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3’

下游：5’-CCACGTCACACTTCATGATGG-3’

PCR反应体系为25 μL，反应条件：95 ℃预变性10 min→95 ℃变性15 s→60 ℃退火1 min→72 ℃延伸45 s，共40个循环。其中目的基因GKN1基因的退火温度为65.3 ℃，管家基因β-actin基因的退火温度为63 ℃。置于实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems ViiATM7 Real-Time PCR System，美国)进行实时定量扩增，采用内参基因进行校正检测结果。

1.2.6定量PCR数据分析和修正以T-099癌组织表达为准(calibrator)，即它的表达量设为1，量化其他样本的表达量，同时以β-actin为内参基因对目的基因的表达进行标准化；在调整基线循环(baseline)和计算阈值(threshold position)后，采用RQ=2-△△Ct法比较目的基因GKN1的相对表达量，仪器自动得出Ct值(threshold cycle)，所得的Ct值，运用相对定量的计算公式，计算得出RQ值，代表目的基因的相对表达量。为了便于统计，把RQ值取lgRQ进行分析[8]：

△Ct=CtGKN1-Ctβ-actin

△△Ct=△Ct-△CtT-099

RQ=2-△△Ct

2　结　果

2.1EBV感染与患者临床病理特征的关系EBVaGC患者中，EBER阳性，具有低分化癌伴大量淋巴细胞浸润等形态学特点(图1)。EBV感染与Lauren’s分型及年龄密切相关(P=0.01，χ2=6.63；P=0.05，χ2=3.84，表2)，而与性别、肿瘤部位、病理类型及TNM分期无显著相关性(P>0.05，表1)。

表1EBV感染与患者临床病理学特征的关系

Tab 1Correlation between EBV infection andpathological features of gastric cancer

表中数据为n.EBV：EB病毒.同一指标内比较，☆：P<0.05.

2.2GKN1蛋白在胃黏膜病变过程中的表达免疫组织化学染色结果显示，正常胃黏膜组织中，GKN1定位于胃黏膜柱状上皮细胞的胞质，呈强阳性，而在肠化胃黏膜、慢性胃溃疡、高级别上皮内肿瘤以及浸润性腺癌中，GKN1均呈阴性(图2)。

2.3GKN1 mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达水平

应用实时定量PCR检测结果如图3，胃癌组织及相应的癌旁组织中，GKN1 mRNA表达水平的均值分别为0.56和2.36，二者间差别具有统计学意义(P<0.01)。相对于相应的癌旁组织，胃癌组织中GKN1 mRNA表达水平降低了63.5倍。GKN1在胃癌组织及相对应的癌旁组织的免疫组织化学结果与以上结果一致(图4)。

2.4胃癌组织中GKN1 mRNA表达与临床病理学特征的关系胃癌组织中GKN1 mRNA的表达水平及其分布如图3，其与临床病理学特征的关系见表2。GKN1 mRNA的低表达水平与肿瘤大小(P=0.012)、发生部位(P=0.022)及EBV感染(P=0.034)密切相关，且肿瘤直径<5 cm的病例组GKN1 mRNA的表达水平是肿瘤>5 cm病例组的8.1倍；非食管胃交界病例组GKN1 mRNA的表达水平是食管胃交界病例组的9.1倍；EBVaGC组GKN1 mRNA的表达水平是非EBVaGC组的6倍。GKN1 mRNA的相对表达水平与性别、TNM分期、淋巴结转移、浸润程度及分化程度无明显相关性(P>0.05)。

3　讨　论

3.1GKN1表达与胃癌临床病理特征的关系GKN1作为一种胃组织特异性蛋白，在正常胃黏膜组织中大量表达，而在胃癌及癌前病变组织中表达下调或缺失，具有维持胃黏膜的完整性和促进受损黏膜修复的功能，是一类潜在的抑癌基因[9]。本研究结果显示，癌旁组织GKN1 mRNA表达水平明显高于癌组织，表明GKN1在胃癌中普遍存在低表达或丢失现象。同时，免疫组织化学结果也显示，在肠化生胃黏膜组织、胃溃疡组织、胃高级别上皮内肿瘤组织及癌组织GKN1都出现低表达或缺失，表明在胃黏膜病变过程中GKN1出现缺失。这与Menheniott的研究结果一致[10]。另外，本研究还显示，GKN1 mRNA的表达水平与肿瘤大小(P=0.012)密切相关，且肿瘤直径<5 cm的病例组GKN1 mRNA的表达水平是肿瘤直径>5 cm病例组的8.1倍，提示GKN1表达可能对肿瘤的生长具有抑制作用。Rui等研究结果表明，GKN1在胃癌组织和细胞系中表达明显下调，GKN1具有抑制胃癌细胞体外和体内增殖的能力[7]，与笔者的研究结果一致。其他研究也显示，GKN1与胃癌侵袭转移密切相关，GKN1通过上调抗氧化酶、锰过氧化物歧化酶及过氧化氢酶含量，降低ROS水平，减少纤连蛋白、波形蛋白、β-catenin、slug、snail以及Cyclin D1的表达，从而抑制上皮-间质转化EMT阻止肿瘤细胞的侵袭转移[6]。以上结果提示，GKN1在胃癌的发生、发展中起重要作用，可能是胃癌早期诊断和筛查的一个潜在的分子标志物，并有可能成为胃癌的治疗新靶点。

表2GKN1 mRNA的表达与临床病理学特征的关系

Tab 2Correlation between tumor GKN1 mRNA expression and pathological features of gastric cancer

同一指标内比较，☆：P<0.05.

3.2GKN1表达与EBVaGC的关系EBV是一种DNA双链病毒，长期慢性感染人类可引起鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T细胞淋巴瘤等[11]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子。EBVaGC约占所有胃癌病例的10%，预计每年有80 000新增的EBVaGC患者[12]。EBVaGC多发生于贲门及胃体部，呈溃疡型，EBER阳性，具有低分化癌伴大量淋巴细胞浸润等形态学特征[12]。笔者的研究结果显示，EBV感染与胃癌Lauren’s分型及患者年龄密切相关。其他研究还表明，EBVaGC具有独特的生物学行为，包括PIK3-CA通路突变、DNA超甲基化、PD-L1和PD-L2基因拷贝数增加等分子特征[13]。以上结果提示，EBV可能在胃癌发生、发展中扮演着重要角色。

本研究中，笔者分析发现，GKN1 mRNA的表达水平与EBV感染密切相关，病例组GKN1 mRNA的表达水平是对照组的6倍。近年来研究发现，EBV感染引起胃癌相关基因启动子异常甲基化、基因功能异常、细胞抗凋亡作用以及胃局部微环境改变在EBVaGC的发生发展中发挥重要作用[5]。EBV的重要蛋白EBNA1可以直接结合到GKN1的启动子，从而影响该基因表观遗传学改变[14]。以上结果提示，GKN1 mRNA的表达水平与EBVaGC密切相关。而EBVaGC是胃癌的一种特殊类型，它的形态特征及基因变化有别于其他类型的胃癌，但相关研究仍较少。下一步研究工作，笔者将在临床病例研究的基础上进行功能和机制的研究，明确GKN1在EBVaGC的作用机制。

[1]Bornschein J,Rokkas T,Selgrad M,et al.Gastric cancer:clinical aspects,epidemiology and molecular background[J].Helicobacter,2011,16(Suppl 1):45-52.

[2]代敏,任建松,李霓,等.中国2008年肿瘤发病和死亡情况估计及预测[J].中华流行病学杂志,2012,33(1):57-61.

[3]Colotta F,Allavena P,Sica A,et al.Cancer-related inflammation,the seventh hallmark of cancer:links to genetic instability[J].Carcinogenesis,2009,30(7):1073-1081.

[4]Ryan J L,Jones R J,Kenney S C,et al.Epstein-Barr virus-specific methylation of human genes in gastric cancer cells[J].Infect Agent Cancer,2010,5:27.

[5]Geddert H,zur Hausen A,Gabbert H E,et al.EBV-infection in cardiac and non-cardiac gastric adenocarcinomas is associated with promoter methylation of p16,p14 and APC,but not hMLH1[J].Cell Oncol (Dordr),2011,34(3):209-214.

[6]Yoon J H,Kang Y H,Choi Y J,et al.Gastrokine 1 functions as a tumor suppressor by inhibition of epithelial-mesenchymal transition in gastric cancers[J].J Cancer ResClinOncol,2011,137(11):1697-1704.

[7]Xing R,Li W,Cui J,et al.Gastrokine 1 induces senescence through p16/Rb pathway activation in gastric cancer cells[J].Gut,2012,61(1):43-52.

[8]Lin X D,Chen S Q,Yuan L Q,et al.Overexpression of thrombospondin-1 in stromal myofibroblasts is associated with tumor growth and nodal metastasis in gastric carcinoma[J].J Surg Oncol,2012,106(1):94-100.

[9]Yoon J H,Choi W S,Kim O,et al.The role of gastrokine 1 in gastric cancer[J].J Gastric Cancer,2014,14(3):147-155.

[10]Menheniott T R,Kurklu B,Giraud A S.Gastrokines:stomach-specific proteins with putative homeostatic and tumor suppressor roles[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2013,304(2):109-121.

[11]Kaneda A,Matsusaka K,Aburatani H,et al.Epstein-Barr virus infection as an epigenetic driver of tumorigenesis[J].Cancer Res,2012,72(14):3445-3450.

[12]Chen J N,He D,Tang F,et al.Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma:a newly defined entity[J].JClinGastroenterol,2012,46(4):262-271.

[13]Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma[J].Nature,2014,513(7517):202-209.

[14]Sivachandran N,Dawson C W,Young L S,et al.Contributions of the Epstein-Barr virus EBNA1 protein to gastric carcinoma[J].J Virol,2012,86(1):60-68.

(编辑：何佳凤)

The Expression and Significance of Gastrokine 1 in Epstein-Barr Virus Associated Gastric Cancer

LIN Jieqiong,LIN Xiandong,ZHENG Xiongwei,HU Dan,CHEN Gang,YING Mingang

Teaching Hospital of Fujian Medical University,Department of Pathology,Fujian Provincial Cancer Hospital,Fujian Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Medicine,Fuzhou 350014,China

ObjectiveTo analyse the correlation of EBV infection to the gastric cancer and the relationship of the expression of gastrokine 1 (GKN1) in the gastric cancer with EBV infection and clinicopathologicalfeatures,for providing theoretical basis to the treatments,controls and preventions of Epstein-Barr virus associated gastric cancer(EBVaGC).Methods104 cases of gastric adenocarcinoma and adjacent tissue were collected to analyze the realationship between EBV infection and clinical pathological features of gastric cancer.The expression of GKN1 was detected by immunohistochemical method in chronic gastritis,intestinal metaplasia,chronic gastric ulcer cases,carcinoma in situ cases and gastric carcinoma.Meanwhile,the mRNA expression level of GKN1 in the 104 gastric cancer tissues and corresponding adjacent tissues were examined by real-time quantitative PCR and investigate the relationship between the expression level of GKN1 and the clinicopathological characteristics.ResultsThe EBV infection was closely correlated to Lauren’s subtype and the age (P<0.05),while there was no significant association between EBV infection and sex,tumor site,pathological classification and TNM stage(P>0.05).The difference between GKN1 mRNA expression in gastric carcinoma and adjacent tissues was statistically significant.The low expression level of GKN1 mRNA was closely related to tumor size (P=0.012),location (P=0.022),and the EBV infection(P=0.034).ConclusionsGKN1 may be a specific biomarker for EBVaGC.

herpesvirus 4,human; stomach neoplasms; tumor markers,biological

2016-03-28

国家临床重点专科建设项目(2013-ZQN-JC-8)；福建省卫计委创新课题(2015-CX-7)；福建省卫计委中青年骨干人才培养项目(2015-ZQN-JC-7)

福建医科大学 教学医院、福建省肿瘤医院 病理科，福建省肿瘤转化医学重点实验室，福州350014

林洁琼(1990-)，女，福建医科大学2013级硕士研究生

郑雄伟.Email:agu1960@126.com

R322.44；R735.2

A

1672-4194(2016)04-0237-05