塑化剂邻苯二甲酸二丁酯与小牛胸腺DNA的沟槽结合

李 松，张国文

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047)

塑化剂邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate,DBP)是广泛应用于工业生产，并存在于人们生活环境中的一种工业添加剂，为潜在有毒有害物质。研究表明，DBP作为一种雌激素类似物，主要对人体具有生殖和发育毒性[1]，另外还有一定的基因毒性和致癌性[2]。近年，塑化剂威胁人类健康的事件屡见不鲜，人们也越来越关注其安全性问题。DNA是重要的遗传物质，在生命过程中发挥着重要作用，并掌控着遗传信息的复制、转录和表达[3]，此外，DNA还是许多小分子在体内的作用靶点。小分子与DNA相互作用的研究能够在分子水平提供其结合机制，以及小分子对DNA构象的影响等信息，有助于深入了解有害小分子对人体的毒理效应。

DBP在动物体内的毒性实验已有一些研究[1,2]，但在体外与DNA相互作用还未见报道。本文以小牛胸腺DNA(ctDNA)为作用靶点，采用体外实验，在模拟人体生理酸度(pH=7.4)条件下，应用多种光谱学方法、化学计量学，以及分子模拟技术研究DBP与ctDNA相互作用，以期为认识DBP与ctDNA的作用机制及DBP的毒性行为提供理论基础。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

F-7000型荧光光度计(日本，日立公司)；UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；MOS 450型圆二色光谱仪(法国，Bio-Logie公司)；Nicolet-5700型红外光谱仪，配置ATR附件(美国，Nicolet公司)；乌氏粘度计(上海前锋橡塑玻璃制品厂)；pHS -3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。

DBP标准品(纯度≥99.5%，阿拉丁试剂公司)用95%乙醇配制成2.0×10-3mol·L-1的储备溶液； ctDNA(Sigma公司)用0.1 mol·L-1NaCl溶液溶解，其浓度利用ε260=6 600 L·mol-1·cm-1[4]确定为2.45×10-3mol·L-1，测得A260/A280>1.80，表明ctDNA已充分脱去蛋白质；超螺旋pUC18质粒DNA(索莱宝试剂公司)；0.05 mol·L-1pH=7.4的Tris-HC1缓冲溶液。上述溶液均保存于4 ℃冰箱中备用，其他试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1构建紫外吸收光谱数据矩阵实验1：固定ctDNA溶液浓度为6.24×10-5mol·L-1，然后以每次2.0×10-6mol·L-1的浓度间隔加入31次DBP；实验2：保持DBP溶液浓度为8.0×10-5mol·L-1不变，依次滴加浓度间隔为2.08×10-6mol·L-1的ctDNA 31次，至最终浓度为6.45×10-5mol·L-1。每次加样后均混匀静置4 min，待充分反应后进行紫外光谱测定，记录波长215～350 nm数据，共136个数据点，得到了DctDNA(32×136) 和DDBP(32×136)两个数据矩阵，组成[DctDNA,DDBP]矩阵。

1.2.2多元曲线分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS) MCR-ALS是一种能够分析数据矩阵、特征重叠光谱，并从复杂反应系统中记录每一个参与组分的响应信号和浓度变化的有效方法[5]。该方法可以帮助我们从复杂反应系统中得到更多本质直观的信息,如浓度变化、纯光谱等。解析步骤如下：(1)构建扩展数据矩阵,通过奇异值分解(SVD)方法分析获取体系中主要组分数目；(2)用渐进因子分析法(EFA)初步估计初始浓度，得到ALS迭代的初始浓度矩阵；(3)运用ALS进行迭代优化。

对于二维光谱数据矩阵，根据以下代数模型进行双线性分解[6]:

D=C×ST+E

(1)

其中，D分别为光谱矩阵；C为浓度矩阵；ST为纯光谱矩阵；E为误差矩阵。

将1.2.1得到的光谱数据矩阵分解为：

(2)

1.2.3荧光光谱的测定分别在298、304和310 K三个温度下向浓度为6.67×10-5mol·L-1的DBP溶液中连续滴加浓度间隔为6.24×10-6mol·L-1的ctDNA，在激发波长为254 nm，激发和发射狭缝均为2.5 nm下，扫描溶液在280～400 nm的荧光发射光谱。为消除紫外重吸收和内滤效应，所有荧光数据均采用文献方法[7]对荧光数据进行校正。

1.2.4琼脂糖凝胶电泳实验将超螺旋pUC18质粒(DNA 3 μL，400 μg/mL) 用不同浓度的DBP处理并用Tris-HCl缓冲液稀释至10 μL。在37 ℃水浴中孵化24 h后加入上样缓冲溶液(包含0.03%溴酚蓝、0.03%二甲苯蓝和30%甘油)。准备1.0% 琼脂糖凝胶，用GoldView 溶液染色，放入含有1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，将样品加入加样孔中，在80 V电压条件下电泳30 min，之后取出凝胶进行紫外成像。

1.2.5分子模拟从 Protein Data Bank 库获取B型DNA的结构(PDB ID:453D)，对接运行前对DNA进行去水、加氢和Gasteiger 电荷修饰。配体DBP模型通过SYBYL×1.1软件构建，并在MMFF94力场使用MMFF94电荷将其能量最小化优化[8]。采用Autodock 4.2软件进行分子对接(总共100次对接实验)，并用Lamarckian Genetic Algorithm(LGA)算法完成对接计算，以2.0 Å的均方根偏差容量对100次对接结果进行能量分析，获得一系列的能量簇，取能量最低且次数最多的构象进行分析。

2 结果与讨论

2.1 DBP与ctDNA相互作用的紫外吸收光谱

实验1为固定ctDNA浓度连续加入DBP，发现ctDNA位于259 nm处的特征吸收峰强度随着DBP的加入缓慢增大并有一定的蓝移，而位于230 nm附近的吸收强度有较大的增强(图1A)。由实验2结果可见，DBP在230 nm和285 nm处有两个特征吸收峰，随着ctDNA浓度的增加，DBP在230 nm处吸光度先减小后略微增大(图1B)，并且在259 nm处出现一个新峰。DBP与ctDNA光谱高度重叠，很难获得两者相互作用有价值的信息。

2.2 MCR-ALS解析紫外光谱数据矩阵

利用MCR-ALS法对光谱数据扩展矩阵进行分析，通过奇异值分解(SVD)确定反应体系中的组分数。所提取到的前4个特征值分别为112.53、61.41、59.24和7.58，可以预测到体系中存在3种主要组分，即DBP、ctDNA和DBP-ctDNA复合物。MCR-ALS算法解析[DctDNA,DDBP]数据矩阵得到了3种组分浓度变化趋势图，随着DBP加入量的增加，DBP-ctDNA复合物的浓度逐渐增大，伴随着ctDNA浓度逐渐减少(图2A)。相反，当向DBP溶液中加入ctDNA，DBP浓度逐渐降低而DBP-ctDNA复合物的浓度逐渐增加(图2B)，并且解析出的各组分纯光谱曲线(实线)与实际测得光谱曲线(虚线)较好地吻合(图2C)，表明预测反应体系中存在3种主要组分且其浓度变化趋势是可靠的，组分间浓度变化直观地显示DBP与ctDNA发生相互作用形成了复合物。

2.3 ctDNA对DBP荧光光谱影响

当荧光激发波长为254 nm 时，DBP在316 nm处有一个较强的荧光发射峰(图3A)。随着ctDNA的加入，DBP在316 nm的荧光强度显著降低，表明ctDNA猝灭DBP的荧光，两者发生了相互作用。

为了明确其猝灭机制，采用Stern-Volmer方程对荧光数据进行分析[9]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(3)

式中，F0和F分别为加入ctDNA前后DBP溶液的荧光强度;KSV为猝灭常数;Kq为双分子猝灭过程的速率常数;[Q]为猝灭剂的浓度;τ0为没有猝灭剂存在下的荧光分子平均寿命，约为10-8s[10]。

以F0/F对[Q]作图(图3B)，得到3个不同温度下的猝灭常数值，见表1。随着温度的升高KSV的值逐渐减小，且猝灭速率常数Kq达到1012数量级，远大于最大扩散碰撞猝灭速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明ctDNA对DBP的荧光猝灭为单一静态猝灭过程。

此外，由修正的Stern-Volmer方程分析荧光数据[11]：

(4)

以F0/(F0-F)对1/[Q]作图，获得结合常数值Ka(表1)，Ka随着温度升高而降低，表明温度升高复合物稳定性下降，这与静态猝灭机制相符。

2.4 热力学参数及作用力类型的确定

为进一步了解DBP与ctDNA反应热力学过程，其热力学参数可由Van’t Hoff 方程[12]求得，焓变ΔHΘ和熵变ΔSΘ分别为-14.03 kJ·mol-1和28.62 J·mol-1·K-1，表明该反应为放热，疏水作用和氢键是结合作用的主要驱动力，且是一个自发过程[3,13]。

表1 三个温度下的猝灭常数、结合常数及热力学参数

Rais the correlation coefficient for theKSVvalues.Rbis the correlation coefficient for theKavalues.

2.5 ctDNA解链温度及粘度测定

DNA的熔点(Tm)，即为DNA加热发生解链失去一半螺旋结构时的温度，也称解链温度。当小分子嵌插于DNA碱基对当中，DNA结构变得更加稳定，Tm则会明显升高，而通过沟槽与静电作用方式与DNA结合，Tm则不会有明显变化[14]。图4A显示ctDNA与DBP-ctDNA复合物的Tm值没有明显的差异，表明DBP通过沟槽模式与ctDNA结合。

经典嵌插剂嵌入DNA碱基对会引起碱基对间距增大，导致双螺旋松弛，长度变大，使得粘度明显增大，而沟槽结合剂对DNA粘度无明显影响[15]。图4B显示了DBP与小沟结合剂Hoechst33258一样对于ctDNA粘度均无明显影响，这是DBP与ctDNA通过沟槽模式结合的有力证据。

2.6 单、双链ctDNA对DBP荧光猝灭

为探究DBP与ctDNA结合模式，采用双链ctDNA(dsctDNA)与单链ctDNA(ssctDNA)分别对DBP进行荧光猝灭实验。若小分子与ctDNA通过嵌插模式结合，dsctDNA更利于DBP的结合，其对DBP荧光猝灭的程度要强于要ssctDNA，而沟槽结合则相反[16]。图5显示，ssctDNA对DBP荧光的猝灭效应明显强于dsctDNA，进一步表明DBP与ctDNA的沟槽结合方式。

2.7 结合位点

为测定DBP在ctDNA上的结合位点，实验对加入DBP前后的ctDNA分别进行了红外光谱扫描。B型DNA在红外光谱中1 717 cm-1、1 660 cm-1、1 610 cm-1和1 490 cm-1处的特征峰，分别对应鸟于嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的伸缩振动。而1 222 cm-1和1 088 cm-1的特征峰则为磷酸骨架的非对称伸缩振动和对称伸缩振动引起的[17]。随着DBP比例的增大，T碱基和A碱基的峰位有明显的移动，分别从1 667 cm-1移动到了1 659 cm-1，1 610 cm-1移动到1 600 cm-1，而其他各个特征峰均没有出现移动(图6)，表明DBP可能主要结合于ctDNA的A-T碱基富集区[18]。

2.8 ctDNA构象变化

B型构象的ctDNA 有两个分别由右手螺旋结构和碱基堆积引起的特征峰，即245 nm处的负峰和280 nm处的正峰。随着DBP浓度的增大，ctDNA负峰增强、正峰减弱(图7)，表明B型ctDNA结构变得更为松散[19]。

2.9 DNA损伤检测

采用琼脂糖凝胶电泳实验通过检测DBP对pUC18质粒DNA可能的损伤。当环状超螺旋DNA进行电泳时，可能出现3种形式，即Form Ⅰ(环状)、Form Ⅱ(开环状)和Form Ⅲ(线状)，它们在凝胶中的迁移速率为Form Ⅰ>Form Ⅲ>Form Ⅱ[20]。电泳图中并没有出现除Form I外的其他条带(图8)，表明该浓度范围内DBP没有造成DNA明显损伤。

2.10 DBP与ctDNA的分子对接

通过Autodock软件对整个DNA模型范围完成100次模拟对接后，形成了由15个构象能量簇构成的能量图(图9(A))。从能量角度考虑，选取能量图中能量最低，次数最多的DBP与ctDNA结合状态进行分析。图9(B)显示DBP与DNA的小沟富集区A-T碱基结合，且与DA5和DA6碱基形成了两个氢键，分子模拟结果与红外光谱实验相一致，进一步确证了DBP与ctDNA沟槽结合模式。

3 结论

在模拟生理酸度(pH=7.4)条件下，联合应用MCR-ALS法结合多种光谱学以及分子模拟技术，研究了DBP与ctDNA的相互作用。结果表明，DBP能与ctDNA发生相互作用形成DBP-ctDNA复合物。ctDNA通过单一的静态方式猝灭DBP的内源荧光，疏水作用和氢键是两者作用的主要驱动力。DBP与ctDNA通过沟槽方式结合，且DBP主要作用于A-T碱基富集区，这种作用诱导B型ctDNA结构变得更为松散，但未对质粒DNA产生明显损伤。研究结果为理解DBP与DNA的相互作用机制和DBP毒理效应提供了有益的信息。