量子点@SiO2微球的水相合成及其在流式分析技术中的应用

刘 岩，白 晓，李婷婷，钟芳丽，沈启慧*，于东冬，周建光

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022；2.浙江大学医院，浙江杭州 310027；3.浙江大学控制科学与工程学院智能系统和控制研究所分析仪器研究中心,工业控制技术国家重点实验室，浙江杭州 310058)

荧光编码微球由于它的高灵敏度、特异性强和高效的编解码模式，可以通过流式分析技术用于多组分微量样品的高通量检测，例如：水质检测、免疫荧光分析、药物代谢、检验检疫[1 - 5]等。用于荧光编码的荧光材料主要包括量子点(QDs)、荧光染料、稀土配合物等，而QDs由于其独特的尺寸可调荧光、超高光强、抗光漂白、具有10～12种荧光颜色的光谱范围等特点[6,7]，更适合进行编码。

SiO2作为编码微球的载体，具有无毒、无味、化学性质稳定以及环境友好等特点。通过原位合成或者内吞的方法制备的QDs@SiO2微球，普遍存在荧光强度低或泄露的问题，与市售的聚苯乙烯载体微球相比，SiO2更难以修饰，因此，限制后续的应用研究。本文采用一步法制备QDs@SiO2微球，通过与QDs表面的配体交换既能保证荧光微球的荧光强度，而且微球表面覆盖高密度的巯基，不需要对微球表面进行活化。该荧光微球克服了泄露的问题，通过流式细胞分析仪的编码检测，可以作为一种高通量的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

德国Heidolph MR Hei-END磁力搅拌器；湘仪H1650高转速离心机；德国Bruker AXS公司D8型X-射线粉末衍射仪(XRD)(操作管压40 kV；管流30 mA；Cu KαL，λ=0.518 416 nm)；美国PE LS-55型荧光分析仪；日本JEOL JSM-6490LV扫描电子显微镜(SEM)(配套能谱仪,EDXA)，美国Tecnai G2 S-Twin F20透射电子显微镜(TEM,操作电压200 kV)；德国Leica DM4000B荧光显微镜(100 W汞灯);美国BD Accuri C6 流式细胞分析仪(488 nm激光光源)。

QDs水溶液(自制[8])，三甲氧基巯基丙基硅烷(MPTMS)(97%，J &K Chemical LTD)，氨水、乙醇(分析纯，天津大茂化学试剂)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)，半胱氨酸(99%，北京索莱宝科技有限公司)，二硫二硝基苯甲酸(DTNB)(99%，TCI)。本实验所用水均为Milli-Q制备的超纯水。

1.2 实验步骤

1.2.1QDs@SiO2荧光微球的制备室温条件下，取MPTMS加入QDs水溶液(橙色荧光)中，恒速磁力搅拌至MPTMS液滴完全消失，呈现透明状。MPTMS与水的质量比为1/50。用浓氨水调节溶液的pH到10，在室温下进行恒速搅拌反应72 h。得到的微球分别用乙醇和水离心清洗两次，所得产物分散在乙醇溶液中，室温保存。测试所需的固体样品需在室温条件下真空干燥。

1.2.2荧光微球表面巯基密度的测定表面巯基含量用DTNB法[9]进行测量。密度的测试在25 ℃条件下，用0.25 mol/L Tris缓冲溶液(pH=8.3)稀释半胱氨酸，形成系列标准溶液，其浓度分别为：0.00、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。取上述各浓度溶液1 mL，分别加入5 mL预先恒温于25 ℃水中的0.1 mmol/L DTNB分析溶液，摇匀后在25 ℃条件下恒温显色10 min后，于波长412 nm处测定吸光度值，根据微球吸光度在标准曲线上对应的浓度，换算出微球表面的巯基含量。

2 结果与讨论

2.1 QDs@SiO2荧光微球的表征

利用MTPMS的巯基与QDs之间的配位能力，通过配体交换取代QDs表面原有巯基丙酸(MPA)，溶液中剩余的MPTMS与另一端的硅酸酯发生水解缩合成球，从而将QDs包覆在微球内。图1a为包裹前后QDs的荧光光谱，包覆后荧光峰位置略蓝移，说明MPTMS作为硅烷，不但能够完成自身的硅烷聚合，而且与QDs具有很好的相容性，配体交换不能导致聚合过程中的光学性质变化。微球表面未配位的MPTMS可以提供大量的活性巯基，尽管巯基在红外区的特征峰很弱，从微球的红外光谱(图1b)上依然可以发现巯基的特征峰(2 556 cm-1)。同时利用DTNB法测的微球表面的巯基含量为0.7 μmol/g，可见本文合成方法的制备条件相对温和，对巯基的稳定性影响比较小，可以减少巯基的氧化和脱落现象的发生，在微球表面能够保留大量的巯基。

图2a为纯SiO2微球与包裹QDs微球的XRD谱图，都可以在20°附近观察到无定型SiO2的衍射峰，但没有CdTe衍射峰的出现，可能是QDs的粒径过小和在硅球中的含量较低导致XRD衍射峰强度过低而难以被发现。但通过EDXA(图2b)可以在微球中检测到Cd和Te元素的存在，从而确定微球包覆了QDs，同时也能看出微球中含有大量的硫元素。另外从TEM照片(图2d)中能够清晰地看到QDs的晶格线，也证明了QDs被SiO2有效包裹，同时QDs没有出现明显的聚集现象，说明MPTMS与MPA的配体交换对硅球的形成没有显著影响。图2e为微球的荧光图片，从图中可以看见明亮的荧光，而且微球具有良好的单分散性(图2c)。

2.2 影响粒径及单分散性的主要因素

2.2.1反应时间对单分散性的影响图3反应时间分别为24、48和72 h制备出的荧光微球的SEM图片，从图中能够清楚地发现，荧光微球都已成球，但反应时间对微球的分散性有明显的影响。这是由于硅烷在碱性条件下水解，MPTMS水解后生成的硅羟基相互脱水缩合形成Si-O-Si健，随着反应时间的延长逐渐缩合成球。当反应时间相对较短，微球表面的硅羟基大部分还没有脱水缩合或部分未水解，微球表面和溶液中还会存在大量的硅羟基，离心清洗时，缩合就可能发生在微球之间，从而导致微球互相粘连在一起。当反应时间延长后，微球表面的游离羟基相互缩合成键，从而避免微球相互粘连提高单分散性。当时间延长到72 h(图3c)，微球基本呈现单分散状，粒径大约为0.95 μm，粒度分布如图3d所示。因此，在室温条件下，反应时间为72 h后得到的微球单分散性最好。

2.2.2反应温度对单分散性的影响在保证微球单分散性的前提下，缩短反应时间为48 h，提高反应温度到40 ℃、50 ℃、60 ℃，从图4中可以看出，得到的产物都已成球，且粘连情况也随温度的升高逐渐改善。可见随着温度的升高，MPTMS的水解和聚合速度都逐渐加快。但温度升高能导致巯基的氧化、脱落等副反应，大大降低了微球表面的巯基含量，不利于微球的后续应用。因此，制备微球最佳的反应温度应该低于50 ℃。

2.2.3反应转速对粒径和粒度分布的影响通过转速控制微球粒径的报导相对较少，因为考察转速对粒径的影响对后续研究具有参考价值。在40 ℃条件下，设定反应时间为48 h，转速为400、500、800、1 000 r/min时，从图5可以得知，在此条件下微球成球率都非常好，随着转速的增加，微球直径从0.9 μm增加到1.25 μm，这是因为增大搅拌速度，能使单体更迅速地附着在微球表面，即促进微球快速生长。转速同样会影响微球的粒度分布，转速较低时，随着搅拌速度的增加，微球的粒度分布先收敛，随后涣散，当转速为500 r/min时，微球的均一性最好，粒度分布系数(微球尺寸的相对标准偏差(RSD))为4.2%(图5d)。

在微球的制备过程中，成核与生长过程不能完全分开，相互之间的竞争相对激烈，当搅拌速度较低，微球的均一性也较差。当搅拌速度增加到500 r/min，单体附着在稳定的核或微粒表面的概率更大，当大量核出现后，单体选择沉积在核表面，独自成核变得不稳定，即使有部分成核，根据Orstwald理论，只有当微粒成长到一定临界尺寸时，它才能继续生长，否则将分解成单体，为其它微粒生长提供活性单体。但是如果继续增加搅拌速度，微粒的生长超过临界尺寸，粒径越大的微粒，比表面积越大，附着单体的概率越大，最终导致粒度分布变宽。

2.3 荧光微球在流式技术中的应用

为验证QDs@SiO2微球作为编码微球的应用前景，将QDs荧光微球作为分析对象，使用BD Accuri C6流式细胞分析仪检测空白荧光微球FMI数值并记录。以四个通道的荧光强度统计结果对FSC-A作图，单位为对数测量单位，从图6中各数据点的分布可以看出，通道2的荧光强度与其他通道的有明显差异。这是因为微球的荧光发射峰位在590 nm，正处于通道2的测试范围(580/45)内，所以通道2的信号强度明显大于其他通道信号，且其他通道信号几乎都小于1 000，可以确定为背景光。另外，因为QDs的激发范围较宽，用同一波长可以激发不同荧光的QDs，因此不同通道可以实现不同QDs荧光微球的同步检测。将荧光微球分散在Tris-HCl、KH2PO4-K2HPO4、HAc-NaAc、NaOH-硼砂等缓冲溶液中，流式检测结果未受影响，证明该方法制备的QDs@SiO2微球具有作为荧光编码微球的潜质。

3 结论

本文通过MPTMS自身水解缩合包覆量子点制备了QDs@SiO2荧光微球，该方法有效提高包覆QDs的数量以及微球的荧光强度和稳定性。通过控制反应时间、温度和转速，确保微球的粒径均一性和单分散性。将微球用于流式细胞术进行测试，能够得到明显的FMI检测结果，具备作为流式分析编码微球的潜质。