钾离子影响下凝血酶适配子在氧化石墨烯表面吸附行为的研究

陈 章，陈国梁，李志贤

(1.湖南科技大学煤炭资源清洁利用与矿山环境保护湖南省重点实验室，湖南湘潭 411201；2.湖南大学化学化工学院，湖南长沙 410082)

K+是生物细胞中含量丰富、作用重要的阳离子之一，因此，开发新型生物传感器以实现生物细胞中K+的特异性、高灵敏检测对于监测细胞生理功能非常重要[1 - 3]。研究发现，凝血酶适配子可以与K+结合形成鸟嘌呤四碱基体结构(又称G-四聚体)[4 - 7]，利用凝血酶适配子的此类特性可以构建检测K+的生物传感器。

氧化石墨烯(GO)作为新型纳米材料，因其独特的物理、化学性质在生物传感器领域具有重要应用前景[8 - 10]。利用核酸适配子可通过π-π相互作用、疏水作用等分子间相互作用力吸附到氧化石墨烯表面的特性，结合氧化石墨烯猝灭荧光基团荧光的性质，构建基于适配子和氧化石墨烯的生物传感器被广泛用于检测核酸、蛋白、生物小分子等目标物[11 - 14]。然而，基于凝血酶适配子和氧化石墨烯构建的生物传感器较少被用于检测K+[15]。其中一个重要原因是K+与凝血酶适配子结合形成G-四聚体后，在K+屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯表面的静电斥力作用下，G-四聚体重新吸附到氧化石墨烯表面，从而降低K+检测的灵敏度。因此，探讨K+条件下，凝血酶适配子形成G-四聚体在氧化石墨烯表面的吸附行为，对于提高此类型生物传感器的检测灵敏度具有非常重要的意义，同时对于研究K+影响下富含鸟嘌呤的适配子在氧化石墨烯表面的吸附行为具有重要借鉴意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

氧化石墨烯(GO)使用JEM3010型透射电子显微镜(TEM)(日本，电子公司)表征。荧光强度使用PE-LS55型荧光分光光度计(Perkin Elmer,Inc)记录，激发波长为480 nm，激发和发射狭缝10 nm，扫描速度为1 500 nm/s。所有操作均在室温条件下进行。

5′FAM-GGT TGG TGT GGT TGG 3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。石墨粉购自Sigma-Aldrich公司。Tris、KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2等试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 氧化石墨烯的制备

氧化石墨烯的制备方法参照Hummers法[16]，制备的氧化石墨烯使用超纯水溶解，超声2 h，最终氧化石墨烯的浓度为0.5 g/L。

1.3 不同浓度氧化石墨烯对适配子荧光强度的影响

5 mmol/L Tris缓冲溶液(pH=7.2，含100 nmol/L FAM标记的适配子)中加入不同浓度的氧化石墨烯，反应30 min，荧光检测。

1.4 K+对适配子在氧化石墨烯表面吸附行为的影响

Tris缓冲溶液中加入氧化石墨烯，最终氧化石墨烯的浓度为35 μg/L，5 min后，加入不同浓度K+，每间隔2 min检测一次荧光，持续30 min。Tris缓冲溶液中加入氧化石墨烯，最终氧化石墨烯的浓度为35 μg/L或者70 μg/L，5 min后加入不同浓度K+，反应30 min，荧光检测。

1.5 不同离子对氧化石墨烯猝灭适配子荧光效率的影响

Tris缓冲溶液中加入氧化石墨烯，最终氧化石墨烯浓度为70 μg/L，5 min后加入不同浓度K+、Na+、Ca2+或者Mg2+，反应30 min，荧光检测。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度的氧化石墨烯对适配子荧光强度的影响

研究采用Hummers法成功制备了氧化石墨烯，图1为制备的氧化石墨烯的透射电子显微镜(TEM)表征图。已有研究证实基于氧化石墨烯优良的单链核酸吸附能力和荧光猝灭能力所构建的生物传感器，主要借助荧光分析手段对目标物进行检测[17,18]，因此本研究借助荧光分析手段探讨凝血酶适配子在氧化石墨烯表面的吸附行为。如图2所示，氧化石墨烯浓度越大，FAM标记的适配子荧光强度越小，说明氧化石墨烯浓度越大对适配子荧光猝灭能力越强。同时研究发现较低浓度的氧化石墨烯对适配子荧光猝灭能力有限。为了排除高浓度氧化石墨烯对适配子荧光影响的因素，本实验过程选用较低浓度的氧化石墨烯(例如35 μg/L或者70 μg/L)。

2.2 K+对适配子在氧化石墨烯表面吸附行为的影响

如图3所示，0 mmol/L K+时，随着反应时间的增加，荧光检测信号变化不明显；随着K+的加入，荧光检测信号增加，伴随反应时间的延长，荧光检测信号逐渐减小。实验结果表明，当不存在K+时，适配子短时间内在氧化石墨烯表面达到吸附平衡；伴随K+的加入，适配子形成G-四聚体结构从氧化石墨烯表面解吸，荧光检测信号增强，随着反应时间的延长，K+屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯之间的静电斥力，适配子重新吸附到氧化石墨烯表面，荧光检测信号减小。研究结果说明适配子形成G-四聚体脱离氧化石墨烯表面后，重新吸附到氧化石墨烯表面需要一定反应时间。研究结果暗示较长反应时间将影响此类型生物传感器检测K+的灵敏度。

研究发现随着K+浓度的增加，荧光强度逐渐减小。虽然高浓度K+有利于G-四聚体形成，但是高浓度的K+更有利于屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯之间的静电斥力，G-四聚体与氧化石墨烯结合更紧密，荧光强度反而更小。见图4。

研究说明，不存在K+时，以单链形式存在的适配子通过π-π相互作用、疏水作用等分子间作用力结合到氧化石墨烯表面；伴随K+的加入，适配子形成刚性结构的G-四聚体，带负电的核酸链与氧化石墨烯表面的负电荷形成静电斥力，适配子从氧化石墨烯表面解吸附，荧光得到恢复；随着K+浓度的增加，高浓度的K+屏蔽部分G-四链体与氧化石墨烯表面的静电排斥力，G-四聚体重新吸附到氧化石墨烯表面，荧光强度减小，其示意图见图5。

如图6所示，研究证实相同浓度氧化石墨烯条件下，随着K+浓度从5 mmol/L增加到20 mmol/L，荧光猝灭效率逐渐增强；相同浓度K+条件下，70 μg/L 氧化石墨烯带来更高荧光猝灭效率。研究结果说明虽然高浓度K+有利于适配子形成G-四聚体，但是其屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯之间的静电斥力效果更显著，荧光猝灭效率反而更高。比较5 mmol/L K+条件下，35 μg/L 和70 μg/L 氧化石墨烯荧光猝灭效率发现，35 μg/L 氧化石墨烯未引起荧光猝灭，70 μg/L 氧化石墨烯具有显著荧光猝灭效应，研究结果揭示在低浓度K+和氧化石墨烯条件下，凝血酶适配子形成G-四聚体脱离氧化石墨烯表面的趋势强于其重新吸附到氧化石墨烯表面的趋势。研究表明为避免脱离氧化石墨烯表面的G-四聚体重新吸附到氧化石墨烯表面，提高K+检测灵敏度，需充分考虑实验过程中氧化石墨烯浓度和K+检测范围。

2.3 不同离子影响氧化石墨烯吸附适配子研究

如图7所示，Na+影响下，荧光强度仍有降低，但弱于K+对氧化石墨烯荧光猝灭能力的影响。K+帮助凝血酶适配子形成刚性G-四聚体结构，G-四聚体暴露在外的碱基上的正电荷与氧化石墨烯表面的负电荷的作用加上碱基的芳香环与氧化石墨烯间的疏水作用，同时结合K+屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯之间的静电斥力作用，G-四聚体将重新吸附到氧化石墨烯表面，适配子荧光强度降低。Na+虽然与凝血酶适配子有一定结合能力，但结合能力弱于K+[19]，此时凝血酶适配子主要以自由卷曲的单链形式存在。Na+增强氧化石墨烯猝灭核酸荧光能力，主要是因为带正电的Na+屏蔽氧化石墨烯和单链核酸之间的静电斥力，成为单链核酸和氧化石墨烯之间桥梁，帮助以单链形式存在的适配子更加紧密的吸附到氧化石墨烯表面[20]。

此外，我们比较了50 mmol/L K+、Na+、Ca2+、Mg2+条件下，氧化石墨烯猝灭适配子的荧光效率。如图8，50 mmol/L Ca2+、Mg2+条件下氧化石墨烯猝灭荧光能力最强，其主要原因是相同浓度的二价离子携带更多正电荷，屏蔽氧化石墨烯和单链核酸之间的静电斥力能力更有效，以单链形式存在的适配子结合氧化石墨烯更紧密。研究结果说明，构建以凝血酶适配子和氧化石墨烯为基础的K+检测生物传感器，不能忽视检测体系中离子种类和离子浓度对检测特异性和检测灵敏度的影响。

3 结论

本研究证实K+条件下，凝血酶核酸适配子与K+结合形成G-四聚体，G-四聚体脱离氧化石墨烯表面，使适配子荧光得到恢复。随着K+浓度的增加，K+屏蔽G-四聚体与氧化石墨烯之间的静电斥力，导致G-四聚体重新吸附到氧化石墨烯表面，荧光被猝灭；K+和氧化石墨烯浓度越高，G-四聚体重新吸附到氧化石墨烯表面趋势越强。研究结果说明，提高以凝血酶适配子和氧化石墨烯为基础的K+检测生物传感器的检测灵敏度和特异性，需要充分考虑检测体系中氧化石墨烯浓度，K+检测范围和检测体系中其它共存离子种类和浓度的影响，同时还应合理设定反应时间。本研究希望通过探讨K+影响下，凝血酶适配子在氧化石墨烯表面吸附-解吸-再吸附作用特点，为优化设计基于核酸和氧化石墨烯的生物传感器提供研究参考，为研究K+影响下富含鸟嘌呤的适配子在氧化石墨烯表面的吸附行为提供借鉴。