高效液相色谱-荧光法同时测定人体尿液中的酪氨酸和色氨酸

杨永丽，崔盼盼，谭 婷，刘 翻，郭 岚，万益群*，

(1.南昌大学化学学院，江西南昌 330031；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

氨基酸在人体新陈代谢过程中起着重要的作用，是人体健康状况的重要参数。酪氨酸(Tyr )和色氨酸(Typ)是两种人体必不可少的氨基酸，它们是合成许多神经递质及其它多种重要化合物的前体物质，其代谢状况对人体有重要的病理及生理意义[1 - 4]。定量分析人体体液或组织中Tyr和Typ的含量不仅在蛋白质化学及评价食物营养价值方面意义重大，而且在多种疾病的基础研究和诊断治疗方面有重要的作用。目前，分离检测氨基酸含量的方法主要包括：离子交换色谱法[5,6]、衍生化气相色谱法[7,8]、毛细管电泳法[9 - 11]和柱前衍生-反相高效液相色谱法[12 - 15]等。在上述方法中，高效液相色谱法的样品前处理较为简单、灵敏度高、特异性好且能同时测定几种氨基酸，临床应用较为广泛。现有文献所报道的有关血清中Tyr和Typ分析研究的报道较多，但对人体尿液中Tyr和Typ含量同时测定的报道相对较少。

本文根据Tyr和Typ具有较强的自然荧光的特性，建立了高效液相色谱-荧光检测法测定健康人、普通病人及癌症患者尿样中Tyr和Typ的含量，取得了较为满意的结果。该方法操作简单，样品分析时间短，满足实际尿液分析要求，可为癌症的临床进一步研究提供一种新的技术手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国,Agilent公司)，配有荧光检测器；Ohaus A P210电子分析天平(精确到0.01 mg)；KQ-50DB型数控超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；TDL-5-A 型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；Millipore-Q Gradient 超纯水装置(美国，Millipore公司)。

酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Typ)标准品均购自于美国Sigma公司。分别准确称取适量的Tyr和Typ标准品，置于2个25 mL的棕色容量瓶中，加入数滴1.0 mol/L NaOH溶液溶解，并用超纯水稀释至刻度，摇匀，配成100.0 μg/mL Tyr和127.0 μg/mL Typ的标准储备液，置于冰箱内4 ℃保存，使用时配成所需要的浓度。甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 色谱分析条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱温为室温；流动相：水-乙腈(80∶20,V/V)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；荧光检测波长：λex=260 nm、λex=340 nm。

1.3 样品采集及前处理

健康人尿样由南昌大学志愿者提供；普通病人尿样由江西省中医院提供；癌症病人尿样由南昌大学第一附属医院提供。取供试者的晨尿2.0 mL左右，置于5 mL的塑料离心管中，然后以6 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm水相滤膜。取滤液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中，进行色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 流动相的组成及流速的选择

分别采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲溶液(pH=6.56、7.0、7.43)作为流动相，考察了不同配比和流速下流动相对Tyr和Typ液相色谱分离行为的影响。结果表明：甲醇-水体系作流动相时，Tyr和Typ的分离度高，但两者保留时间显著延长；乙腈-磷酸盐缓冲液(pH=6.56、7.0、7.43)体系作流动相时，色谱峰保留时间有所缩短，但尿样中的杂质对测定产生一定干扰；当以乙腈-水=20∶80为流动相，流速为1.0 mL/min，荧光检测波长为λex=260 nm、λem=340 nm时，Tyr和Typ的色谱分离效果较好，具有较高的信号响应和合适的分析时间。因此，确定乙腈-水为流动相体系。Tyr和Typ色谱图见图1。

2.2 样品前处理方法的选择

人体尿液成分复杂，必须除去干扰Tyr和Typ检测的杂质，以保证分析结果的准确性。本文分别考察了以下三种尿样前处理方法：(1)取晨尿2.0 mL置于5 mL的塑料离心管中，以6 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm的水相滤膜。取滤液1.0 mL定容于5 mL容量瓶中，进行色谱分析。(2) 将采集的晨尿按体积比为10∶1的比例加入HCl，避光放置10 min，常温下以5 000 r/min离心5 min。取上清液6.0 mL，加入2.0 mL的30 g/L三氯乙酸充分混匀，以6 000 r/min离心10 min，取上清液1.34 mL，加入1.0 mL的碱中和，加水至5 mL后过0.45 μm的水相滤膜，进行色谱分析。(3)取晨尿1.0 mL置于5 mL的塑料离心管中，加2.0 mL乙腈，以6 000 r/min离心10 min，静置15 min，过0.45 μm的水相滤膜，定容至5 mL容量瓶中，进行色谱分析。

将空白尿样和添加Tyr和Typ标准溶液的尿样按上述三种方法处理，在已选定的色谱条件下进行分析，每个水平重复实验3次。结果发现：三种方法的平均回收率在83.7%～120.2%之间，均可满足实际样品的分析要求。但采用方法(3)处理测得的Tyr和Typ峰面积响应值均较低，这可能是由于采用乙腈作沉淀剂导致Tyr和Typ与蛋白质共沉淀；采用方法(2)测定的酪氨酸峰面积响应值较低，色氨酸的峰形较差且方法较为繁琐；而方法(1)操作简便，且Tyr和Typ的荧光响应强度较高，所以本实验采用方法(1)对尿样进行前处理。

2.3 干扰试验

实验考察了尿样中主要共存的无机物和有机物对1.0 μg/mL Tyr及Typ分析的影响。当相对误差在±5%范围内，共存物质的允许量(μg/mL)为：Mg2+(30)，Ca2+(20)，Cu2+(0.1)，Fe3+(0.40)，Mn2+(0.75)，Zn2+(10)，尿素(1 500)，尿酸(15.1)，葡萄糖、果糖、乳糖(108)，肌酸(50)，肌酐(100)，尿卟啉(5.0)，粪卟啉(6.0)，5-羟色胺(4.0)，5-羟吲哚乙酸(5.0)，苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸(160)，胆红素(5.0)。可见尿样中上述共存物质基本不会影响Tyr和Typ的测定。

2.4 标准曲线与检测限

取适量的Tyr和Typ标准储备液，配制成系列浓度的标准工作溶液，在选定的色谱条件下进行测定，以峰面积对浓度作图。Tyr和Typ的含量分别在0.10～6.0 μg/mL及0.05～6.0 μg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程分别为:y=12.219x+0.6694(r=0.9991)和y=83.612x+6.7351(r=0.9993)，以三倍信噪比计算，Tyr和Typ检测限分别是0.05 μg/mL和0.02 μg/mL。

2.5 回收率与精密度试验

取健康人和癌症患者尿样进行加标回收实验。分别添加三个不同水平的Tyr和Typ标准溶液，每个水平测定5次，结果见表1及表2。两种氨基酸的平均回收率在86.3%～122.3%之间，相对标准偏差(RSD)值小于8.51%，该方法可以满足实际样品的分析要求。

表1 健康人尿样加标回收率(n=5)

表2 癌症病人尿样加标回收率(n=5)

2.6 尿样分析

分别取一定量的健康人、普通病人和癌症患者的晨尿，按选定的样品前处理方法和色谱分析条件进行检测，每个尿样平行测定6次，尿样分析结果见表3。由表3可知：Tyr的水平在健康人、普通病人和癌症患者尿样中没有明显差异；Typ在健康人尿样中含量为4.774±0.093～30.532±0.061μg/mL，普通病人尿样中含量为8.122±0.486～27.504±0.298μg/mL；而癌症患者尿样中Typ水平各不相同，其中胃癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿样中Typ的含量与健康人和普通病人相比总体偏低，其含量范围为2.188±0.071～5.289±0.998μg/mL，其他类型的癌症患者Typ的含量没有明显差异，这说明不同类型的癌症，Typ的代谢情况也会不同。

表3 尿样分析结果(n=6)

(续表3)

3 结论

本文建立了高效液相色谱-荧光检测法测定人体尿样中Tyr和Typ的分析方法，该方法样品前处理简便，应用于健康人、普通病人及癌症患者尿样分析，取得了较好效果。从样品分析结果可知，不同类型癌症患者尿样中Typ的水平会有差异，其中胃癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和食管癌患者尿样中Typ的含量与健康人和普通病人相比总体偏低，Typ有可能是这些癌症的特异性标志物，有关这方面的研究将进一步报道。