伊维菌素缓释注射液的制备工艺及在绵羊体内药代动力学研究

任丽君，郭玉娟，姚　军，李新霞，陈　坚

(1.昌吉职业技术学院，昌吉　831100；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830054)



伊维菌素缓释注射液的制备工艺及在绵羊体内药代动力学研究

任丽君1，2，郭玉娟2，姚军2*，李新霞2，陈坚2

(1.昌吉职业技术学院，昌吉831100；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830054)

目的制备伊维菌素缓释注射液，采用HPLC法测定绵羊血浆中伊维菌素的质量浓度并进行药代动力学研究。方法(1)以伊维菌素为原料，用质量分数为2%的硬脂酸铝蓖麻油作为溶剂，制备伊维菌素缓释注射液。(2)采用HPLC法检测血浆中伊维菌素的质量浓度。色谱柱：ZirchromC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(92∶8)；流速：1.0mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：245nm；苏丹Ⅲ为内标。结果(1)制备得到黄色、澄明油状的伊维菌素缓释注射液。(2)伊维菌素质量浓度在2.0～20.0 和20.0～200.0ng·mL-1范围内线性良好(r分别为0.997 7和0.999 3)。最低检测质量浓度为1.8ng·mL-1。样品平均回收率为101.8%。日内、日间精密度的RSD值均小于5%。绵羊皮下注射伊维菌素10mg·kg-1后，其主要药动学参数：tmax=8.0d，Cmax=82.3ng·mL-1，AUC=3 642ng·d·mL-1，MRT=45.9d。结论(1)采用生物体较难吸收的蓖麻油作为溶剂，可以起到长期缓释的目的，缓释作用达4个月。(2)HPLC法简单、准确、可靠，适用于伊维菌素的血药质量浓度分析及药代动力学研究。

伊维菌素缓释注射液；血药质量浓度；药代动力学；高效液相色谱法

伊维菌素(ivermectin，IVM)是一种十六元大环内酯类抗生素，为白色结晶性粉末，无味，性质稳定。Merck公司采用Wilkinson′s均相催化还原法将阿维菌素(avermecti-n，AVM)B1氢化，使碳的22位与23位的双键变为单键，合成22，23-二氢AVMB1，即伊维菌素(Ivermectins，IVM)，见图1。和阿维菌素相比，伊维菌素在低浓度时即可发挥药效，杀灭动物体内、体表的寄生虫，且伊维菌素的毒性和不良反应较低，高效、广谱、对环境影响小，在防治全球性畜禽寄生虫方面发挥着重要的作用[1-2]。

1985年PopeDG等[3]采用渗透泵技术研制出伊维菌素缓释剂，用于防治牛的肠道线虫和外寄生虫感染，缓释效果可达35d左右。1998年ForbesAB等[4]采用Lady的专利技术研制出缓释作用长达100d左右的伊维菌素缓释巨丸剂。该缓释巨丸剂能有效治疗羊体外痒螨(psoroptesovis)的感染，治疗后羊的体质量和皮毛有极大改善。张艳伟等[5]采用空心多孔纳米ZrO2载体材料进行了阿维菌素缓释剂的制备。这些制剂虽然达到了长效、缓释的目的，但仍存在制造工艺复杂及给药不便等问题。新疆牧区牲畜数量多、放牧存在转场及偏远分散等特点，因此给药方便、生产工艺可行和缓释时间长的伊维菌素缓释剂的研制成为一项迫切的任务。

图1伊维菌素的结构式

Fig.1StructureofIVM

本课题组前期进行了中性油凝胶伊维菌素缓释剂的研究，但缓释时间有限[6-7]。本实验制备新型的硬脂酸铝蓖麻油伊维菌素缓释注射液，缓释时间长，1次给药即可防治寄生虫3～4个月，采用反相高效液相色谱法进行了伊维菌素缓释注射液在绵羊体内的药代动力学研究。

1　仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(SCM1000，P2000，UV100，美国热电集团)；ZirchromC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm,美国ZirChromSeparations公司)；高速台式离心机(长沙市鑫奥仪器仪表有限公司)；旋涡混合器(上海乔跃电子有限公司)；微量移液器(郑州泽铭科技有限公司)。

1.2试药伊维菌素原料药，伊维菌素对照品(质量分数均为95%，河北恩威有限公司)；蓖麻油(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津市化学试剂一厂)；单硬脂酸铝(分析纯，天津市河北区海晶精细化工厂)；苏丹Ⅲ内标(分析纯，北京化工厂)；甲醇为色谱纯；水为高纯水。

2　方法与结果

2.1伊维菌素缓释注射液的制备

2.1.1配方伊维菌素：50.0g；乙酸乙酯：85.0mL；质量分数为2%的硬脂酸铝蓖麻油油胶：适量。

2.1.2伊维菌素缓释注射液的制备工艺

2.1.2.1硬脂酸铝蓖麻油油胶制备取适量蓖麻油放入容器中，加热至50 ℃，称取适量单硬脂酸铝置于蓖麻油中，用玻璃棒进行搅拌，直至成白色均匀糊状，溶胀2～4h，继续边搅拌边加热至120～125 ℃，至样品完全透明，停止加热，样品放冷至约50 ℃，采用垂熔漏斗进行抽滤，得质量分数为2%的硬脂酸铝蓖麻油胶A液，颜色呈黄色透明油状。

2.1.2.2伊维菌素乙酸乙酯溶液的制备按照2.1.1项下配方称取伊维菌素原料药适量，加入相应量的乙酸乙酯，充分振荡，采用水浴回流溶解，得B液。

2.1.2.3混合与分装在无菌环境条件下将A液加入到B液中，搅匀，西林瓶密闭分装，即得伊维菌素缓释注射液。

2.2色谱条件色谱柱：ZirchromC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水(92∶8)；流速：1.0mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：245nm；进样量：20μL。

2.3溶液的制备对照品溶液：精密称取伊维菌素对照品0.100 3g，置于100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，再稀释成质量浓度为4.0mg·mL-1的对照品储备液，置于4 ℃冰箱中备用。

供试品溶液:同法配制20.0ng·mL-1的苏丹Ⅲ甲醇溶液，作为内标溶液，置于4 ℃冰箱中备用。

2.4血浆样品的提取分离绵羊静脉取全血10mL，肝素抗凝，以4 000r·min-1离心20min，精密吸取血浆样品2.0mL，加内标溶液20.0μL，旋涡混合2min，再加入2.0mL乙酸乙酯，涡旋2min，离心10min，转速为12 000r·min-1，取上层有机相。同上操作共3次(乙酸乙酯用量分别为2.0，1.5和1.5mL)，合并上层液，50 ℃水浴，N2流吹干。测定前残存物加100.0μL甲醇，涡旋2min，以12 000r·min-1离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，进样20.0μL。

2.5专属性考察该色谱条件下，血浆中的伊维菌素与对照品保留时间一致，血浆样品中的杂质峰及所选内标分离良好，峰形好，且样品峰与杂质峰分离度关于1.5，见图2。

2.6线性关系考察取绵羊空白血浆9份，每份2.0mL，精密加入伊维菌素对照品储备液1.0，2.0，3.0，5.0，10.0，20.0，40.0，75.0和100.0μL，分别加入内标溶液20.0μL，涡旋混合2min，加入乙酸乙酯2.0mL，按照2.4项下方法进行操作，伊维菌素的质量浓度分别为2.0，4.0，6.0，10.0，20.0，40.0，80.0，150.0和200.0ng·mL-1。分别进样，进样量20.0μL，以伊维菌素峰面积与内标峰面积之比Y对伊维菌素血浆质量浓度X (ng·mL-1)进行线性回归，在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范围内回归方程分别为：Y= 0.006 X +0.009 8 (r= 0.997 7)；Y=0.004 9 X+0.030 4 (r=0.999 3)。表明伊维菌素血浆质量浓度分别在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范围呈良好线性关系。其最低检测质量浓度(S/N=3)可达1.8ng·mL-1。

2.7回收率实验吸取伊维菌素对照品储备液5.0，10.0和15.0μL，分别加入本底血浆2.0mL，内标溶液20.0μL，涡旋混合2min，加入乙酸乙酯2.0mL，其伊维菌素加入质量浓度分别为10.0，20.0和30.0ng·mL-1， 每个质量浓度做5份，不加伊维菌素的本底血浆做3份，按照2.4项下方法进行操作，低、中、高回收率(n=5)分别为107%，95.5%和103%；RSD值分别为3.8%，4.4%和2.3%；平均回收率为101.8%。

图2HPLC图

A.空白血浆；B.对照品血浆；C.给药2周后血浆样品；1.内标；2.伊维菌素

Fig.2HPLCchromatograms

A.blankplasma；B.referencesubstanceplasma；C.plasmasampleof2weeksafteradministration；1.internalstandard；2.ivermectin

2.8精密度实验用空白血浆配制含伊维菌素质量浓度为100.0ng·mL-1的标准血样，按照2.4项下方法进行操作，连续进样5次，测定峰面积，RSD值为1.6%。用空白血浆配制含伊维菌素质量浓度为100.0ng·mL-1的标准血样，按照2.4项下方法进行操作，在1d中不同时间点进样，测得标准血浆的日内RSD值为3.2%(n=5)，在5d内的日间RSD值为4.5%(n=5)。

2.9药代动力学参数测定6只绵羊，体质量35～40kg，以10mg·kg-1颈部皮下注射伊维菌素缓释注射液，分别在给药1，2，4，8，15，22，29，36，43，50，57，64，71，78，85，92，99，106，113，120和127d后静脉取血，按照2.4项下方法进行操作，测定血浆药物质量浓度，结果见图3。

图3绵羊皮下注射质量浓度为10mg·kg-1的伊维菌素缓释注射液后平均血药质量浓度-时间曲线

Fig.3Meandrugplasmaconcentration-timecurveaftersingledoseof10mg·kg-1IvermectinSustained-releaseInjectionsinsheep

根据血药质量浓度-时间曲线图进行药动学参数计算AUC，MRT，Cmax和tmax的使用实测值。药动学参数为：tmax=8.0±1.8d，Cmax=82.3±28.9ng·mL-1，AUC=3 642±982ng·d·mL-1，MRT=45.9±5.1d。

3　讨论

伊维菌素为脂溶性化合物，极性较小，选择甲醇-水(92∶8)为流动相，分离度好，伊维菌素峰形较好，内标苏丹Ⅲ与伊维菌素分离较好，灵敏度高，适合于伊维菌素的药物质量浓度检测。本实验建立了HPLC-UV法测定绵羊体内伊维菌素血药质量浓度的方法，与HPLC荧光法[8]以及酶联免疫吸附测定法[9]进行比较，该法的特点是预处理成本低，操作简单；检测限达到1.8ng·mL-1；采用内标法定量，误差小，因质量浓度范围跨度大，可分别在2.0～20.0和20.0～200.0ng·mL-1范围内提高测定准确性及灵敏度。

油类溶剂与动物体液不易混合，因此油性注射剂比《中国兽药典》[10]收载的水性注射剂药物释放更加缓慢，可以达到长效的目的。橄榄油、豆油等植物油是常用的注射用油，而本实验采用动物体不易吸收的蓖麻油作为溶剂，药物的释放更缓慢；硬脂酸铝的加入会使油溶液黏度增加，大大延长药物在动物体内的释放和扩散过程；乙酸乙酯作为伊维菌素溶剂，同时亦作为药物促吸收剂。调节缓释剂与促吸收剂两者的比例，可使制剂达到缓释3～4个月的要求。《中国兽药典》[10]收载的伊维菌素注射液在绵羊体内的作用时间为2～7d左右，哈斯苏荣等[11]测定伊维菌素注射液在细毛绵羊体内的药动学参数为：tmax=31.20±6.57h， Cmax=67.62±9.067ng·mL-1，AUC=7 125.08±908.52ng·h·mL-1，MRT=113.39±9.00h，与本实验制备的伊维菌素缓释注射液的药动学参数进行比较，本实验制备的伊维菌素缓释注射液较伊维菌素注射液的缓释作用大大增强。虽然本实验伊维菌素缓释注射液在绵羊体内的药动学用房室模型不能准确描述其药动学特征，但伊维菌素血药质量浓度检测结果表明,绵羊皮下注射伊维菌素缓释注射液可以达到长效缓释近4个月，给药方式较为简便，非常适合作为新疆牧区牲畜抗寄生虫药物的长效制剂。

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[4]ForbesAB，PittSR，BaggottDG，etal.Areviewoftheuseofacontrolled-releaseformulationofivermectininthetreatmentandprophylaxisofPsoroptesovisinfestationsinsheep.[J]VetParasitol，1999，83(3/4):319-326.

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Study on preparation and pharmacokinetics of Ivermectin Sustained-release Injections in sheep

REN Lijun1,2，GUO Yujuan2，YAO Jun2*，LI Xinxia2，CHEN Jian2

(1.Changji Professional Technology College，Changji 831100， China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

ObjectiveTostudythepreparationprocessofIvermectins(IVM)Sustained-releaseInjections,todevelopanHPLCmethodforthedeterminationofivermectinconcentrationinsheepplasma,andtostudyitspharmacokineticsinsheep.Methods(1)Sustained-releaseInjectionswerepreparedbyusingcastoroilasthesolvent.(2)ThecontentofIVMinIVMSustained-releaseInjectionswasdeterminedbyHPLC-UV.Theplasmasampleswereextractedwithethylacetate.TheanalysisinvolvedaZirchromC18column(250mm×4.6mm，5μm)andmethanol-water(92∶8)asmobilephase.Theflowratewas1.0mL·min-1;thecolumntemperaturewas40 ℃，andtheUVdetectionwavelengthwas245nm.SudanⅢwasusedastheinternalstandard.Results(1)IVMSustained-releaseInjectionswereobtained.(2)Thecalibrationcurvewaslinearovertherangesof2.0-20.0ng·mL-1and20.0-200.0ng·mL-1withcorrelationcoefficientsof0.997 7and0.999 3;thelimitofdetectionwas1.8ng·mL-1;themeanrecoverywas101.8%;theRSDsofintra-dayandinter-daywerelessthan5%;theHPLCmethodofdeterminationofivermectininplasmawasestablished.Aftersingledoseof10mg·kg-1insheep，themainpharmacokineticsparameterswereestimatedtobeasfollows：tmax=8.0d，Cmax=82.3ng·mL-1，AUC= 3 642ng·d·mL-1，MRT=45.9d.Conclusion(1)Byusingthemoredifficultabsorbsolvent,castoroil，along-termsustainedreleasepurposewasachievedwhosesustainedactionwasover4months.(2)HPLCmethodissimple，preciseandreliable，andissuitableforthedeterminationofivermectininplasma.

IvermectinSustained-releaseInjections；drugconcentrationinplasma；pharmacokinetics；HPLC

任丽君，女，硕士，高级讲师

姚军，男，副教授，硕士研究生导师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.017

R944

A

1004-2407(2016)05-0497-04

2016-03-21)