平消胶囊(片)HPLC特征图谱研究

刘　越，罗定强*，康　荣，王国海

(1.陕西省食品药品检验所，西安　710065；2.西安医学院，西安　710021)



平消胶囊(片)HPLC特征图谱研究

刘越1，罗定强1*，康荣2，王国海1

(1.陕西省食品药品检验所，西安710065；2.西安医学院，西安710021)

目的 建立平消胶囊(片)的特征图谱，提高其质量控制水平。方法以甲醇为溶剂，进行超声提取；色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：263 nm；柱温:35 ℃。结果平消胶囊(片)各成分得到了较好的分离，以柚皮苷为参照物，确定了9个共有色谱峰，分别来源于马钱子、枳壳和五灵脂。结论该方法准确、重复性好，可同时分离平消制剂中的多种成分，尤其是对现有标准方法中枳壳主要成分柚皮苷薄层鉴别项易出现假阳性结果的现象进行补充。

平消胶囊(片)；特征图谱；枳壳；质量控制

平消胶囊(片)为2013年国家药品计划抽验品种，现行质量标准收载于《中国药典》2015年版一部，主要由郁金、仙鹤草、五灵脂、白矾、硝石、干漆(制)、枳壳(麸炒)和马钱子粉8味中药组成[1]；具有活血化瘀、散结消肿和解毒止痛的功效；对毒瘀内结所致的肿瘤患者具有缓解症状、缩小瘤体、提高人体免疫力和延长患者生存时间的作用。平消制剂是经临床实践确证的抗癌药，尤其是对乳腺癌、肺癌和食道癌等恶性肿瘤具有较好的疗效[2]。现行的标准方法较简单，鉴别项中只对马钱子和枳壳进行了控制，含量测定项下只对马钱子药材成分中的士的宁进行含量测定，难以有效控制平消胶囊(片)的质量，且枳壳混伪品种较多[3]，多含有与柚皮苷结构类似的黄酮类化合物[4-5]，依据现行标准方法使用硅胶G为吸附剂，乙酸乙酯-甲酸-水三项系统为展开剂，很难有效分离上述黄酮类化合物，容易造成假阳性结果。

作为能体现中药整体特征的指纹图谱和特征图谱分析技术在近年来的质量标准研究中得到了广泛的关注和认可[6-9]。本文对平消胶囊(片)的HPLC 特征图谱进行了系统地方法学考察，并对实验结果进行了分析总结，以期合理提高该制剂的质控标准。

1　仪器与试药

1.1仪器岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(日本岛津公司)；BS224S电子分析天平、BP211D电子分析天平(德国塞多利斯公司)；KQ-500DE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药马钱子碱对照品(批号110706-200505)，士的宁对照品(批号110705-201307)，柚皮苷对照品(批号110722-201312)，新橙皮苷对照品(批号111857-201001)，橙皮苷对照品(批号110721-201316)，马钱子对照药材(批号121164-200302)，枳壳对照药材(批号120981-200403)，五灵脂对照药材(批号121348-200501)，均由中国食品药品检定研究院提供；平消胶囊(片)样品来源于市场抽样；生产用药材、阴性样品由生产企业提供；甲醇(色谱纯，Merck公司)；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2　现行标准方法柚皮苷薄层鉴别假阳性结果

依据现行标准方法，制备供试品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。以硅胶G为吸附剂，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶2∶3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置于紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，提示现有的标准方法容易造成柚皮苷鉴别假阳性结果，见图1。

图1薄层色谱图

1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.样品

Fig.1 TLC chromatogram

1.naringin；2.hesperidin；3.neohesperidin；4.sample

3　特征图谱研究

3.1色谱条件色谱柱(Kromasil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·L-1；柱温：35 ℃；检测波长：263 nm；分析时间：65 min；进样量：10 μL；流动相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液梯度洗脱，见表1。

表1梯度洗脱程序

Tab.1 The mobile phase program of gradient elution

时间/minA,乙腈/%B,5mL·L-1磷酸水溶液/%01585263070416040568020601585651585

3.2对照品溶液和对照药材溶液的制备取马钱子碱、士的宁、柚皮苷和新橙皮苷对照品各5 mg，精密称定，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成1 mL各含0.1 mg的混合对照品溶液，用于色谱峰定位。另取马钱子、枳壳和五灵脂对照药材各1 g，分别加甲醇50 mL，加热回流1 h，滤过，取滤液作为对照药材溶液，用于峰归属。

3.3供试品溶液的制备取平消胶囊(片)适量，研细，取1 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，摇匀，密塞，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.4测定方法分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，以柚皮苷色谱峰为S峰，其余各峰的保留时间与S峰保留时间比值为相对保留时间。

3.5方法学考察

3.5.1精密度实验取同一供试品溶液，在相同色谱条件下连续进样6 次，测定，记录色谱图，以柚皮苷峰为内标准峰。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间与其相对峰面积无明显差异，其RSD值分别为0.1%～0.2% 和0.2%～0.5%，表明本实验仪器及色谱条件的精密度良好。

3.5.2稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，18和24 h时测定，记录色谱图。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积无明显差异，以柚皮苷峰为内标准峰，柚皮苷峰保留时间和峰面积的RSD值分别为0.2%和0.6%，稳定性良好。说明供试品溶液在24 h内稳定。

3.5.3重复性实验取同一批次的样品， 按照3.3项下方法制备供试品溶液6份，按照上述色谱条件进样，测定，记录色谱图。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和其相对峰面积无明显变化，以柚皮苷峰为内标准峰，其RSD值分别为0.6%～0.8%和0.3%～0.5%，重复性良好。

3.5.4色谱峰归属取马钱子碱、士的宁、柚皮苷和新橙皮苷混合对照品溶液以及马钱子、枳壳和五灵脂对照药材溶液，按照上述色谱条件进样，测定，确定各药材主峰的保留时间，与样品色谱图进行比较，结果各药材主峰均在样品色谱图中呈现，且分离度良好，见图2。

图2HPLC图

A.混合对照品；B.样品；C.薄层鉴别易出现假阳性结果样品；

1.马钱子碱；2.士的宁；S.柚皮苷；4.新橙皮苷

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.sample；C.sample of false-positive result；1.brucine；2.strychnine；S.naringin；4.neohesperidin

3.5.5专属性考察取不含每种药材的阴性样品，按照3.3项下方法制备阴性溶液，在相同色谱条件下进样，按照各峰的保留时间对主要色谱峰进行峰归属。

4　样品特征图谱的建立

抽取不同生产企业的平消片和平消胶囊样品共10批，按照3.3项下方法制备供试品溶液，记录色谱图，通过对10批样品的色谱图进行比较，选定其中9个峰为特征峰，并以柚皮苷峰为S峰，计算其余峰的相对保留时间。平消胶囊(片)特征图谱见图2，各峰保留时间及峰归属结果见表2。

表2各特征峰的保留时间及归属

Tab.2 The retention time and the corresponding medicinal materials of characteristic peaks

峰名称保留时间相对保留时间对应药材马钱子碱7.8830.471马钱子士的宁8.2350.492马钱子峰315.4130.921枳壳柚皮苷峰(S)16.7251.000枳壳新橙皮苷18.9231.131枳壳峰528.5231.705枳壳峰640.0752.396枳壳峰741.0672.455五灵脂峰842.7732.557枳壳

5　讨论

5.1方法特点本研究建立的平消胶囊(片)特征图谱，能够同时控制制剂中马钱子、枳壳和五灵脂3味药材的质量，能够从一定程度上体现出平消制剂不同厂家、不同批次之间的稳定性和均一性。另外，枳壳混伪品种较多，多含有与柚皮苷结构类似的黄酮类成分，现有标准方法薄层鉴别容易造成假阳性结果。新建立的高效液相特征图谱方法能够准确地区别上述黄酮类化合物，可用于鉴别制剂中枳壳药材的混伪品。

5.2色谱峰归属制剂中药材的主要色谱峰在263 nm 处均能体现，且在此波长处检测的色谱峰数量较多，响应值较好，故选择263 nm 为检测波长。在此波长处，3种药材均有特征峰呈现，根据峰归属结果，马钱子的特征峰为1和2 号峰，分别为马钱子碱和士的宁，枳壳的特征峰为3，4，5，6和8号峰，S峰柚皮苷和4号峰新橙皮苷为枳壳的主要化学成分，五灵脂药材的特征峰为7号峰。

5.3平消制剂质量标准结合现有标准方法及平消胶囊(片)特征图谱，仍不能有效控制该制剂君药郁金和仙鹤草的质量，同时制干漆为毒性药材，现行质量标准无相应的检验项目，五灵脂仅收载于地方药材标准，无理化检验项目，难以有效控制成品的质量，无法对生产企业可能使用质量不合格的原料药及偷工减料等问题进行有效监管。另一方面，由于矿物药白矾和硝石的存在，可能存在重金属及有害元素超标的隐患，这些问题均有待进一步深入研究。

[1]国家药典委员会.中国药典2015年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：772-773.

[2]刘非，刘健.平消胶囊治疗恶性肿瘤研究概况[J].现代肿瘤医学，2007，15(1)：142-143.

[3]潘隽丽，杨翠平，苏薇薇.枳壳类药材的研究概况[J].中药材，2003，26(10)，768-771.

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[7]王术玲，贾薇，高晓玲．柴胡疏肝散水提液HPLC 特征图谱研究及指标成分的测定[J].中成药，2012，34(12)：2384-2388.

[8]曹瑞，程茜菲，李艳茸，等．维血宁的HPLC指纹图谱研究[J].西北药学杂志，2014，29(3)：247-249.

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HPLC specific chromatograms of Pingxiao Capsules(Tablets)

LIU Yue1，LUO Dingqiang1*，KANG Rong2，WANG Guohai1

(1.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710065，China；2.Xi′an Medical College，Xi′an 710021，China)

Objective To establish the specific chromatogram of Pingxiao Capsules (Tablets) by HPLC，and to improve the quality control.Methods Samples were prepared by ultrasonic extraction with methanol；the Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-5 mL·L-1aqueous phosphoric acid were used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL·min-1and the detection wavelength at 263 nm.The column oven temperature was kept at 35 ℃.Results The constituents of Pingxiao Capsules (Tablets) showed a good separation and nine common peaks were identified with naringin as a reference，which were derived fromStrychnisemen，FructusaurantiiandFaecestrogopterori，respectively.Conclusions The method has advantages of good accuracy as well as reproducibility and can simultaneously separate the multiple components of Pingxiao Capsules (Tablets)，which is also a significant supplement of frequently false-positive results in current standard TLC identification for naringin.

Pingxiao Capsules(Tablets)；specific chromatogram；Fructusaurantii；quality control

国家食品药品监督管理总局上市药品质量分析专项项目

刘越，男，博士，主管药师

罗定强，男，副主任药师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.003

R284

A

1004-2407(2016)05-0448-04

2016-03-13)