HPLC法同时测定大鼠血浆中川芎成分洋川芎内酯 Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸

姜　维，赵　美，陈　曦，郭　舜，刘新友

(第四军医大学唐都医院药剂科，西安　710038)



·药物分析·

HPLC法同时测定大鼠血浆中川芎成分洋川芎内酯 Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸

姜维，赵美，陈曦，郭舜，刘新友*

(第四军医大学唐都医院药剂科，西安710038)

目的建立以HPLC法同时测定大鼠血浆中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸质量浓度的方法。方法含药血浆进行3种提取方法对比。色谱条件为：Agilent5TC-C18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为室温(25 ℃)；流动相为甲醇-2mL·L-1甲酸水梯度洗脱；流速为0.6mL·min-1；检测波长为280nm。结果以乙酸乙酯和正己烷为萃取溶剂的血样处理方法效果最佳；洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸质量浓度分别在2.5～250，2.0～200和1.25～125μg·mL-1范围内线性良好。平均回收率均大于85%，日内和日间RSD值均小于4%。结论该方法的血浆萃取效果较理想，检测方法简便、快速、灵敏、可靠，可应用于血浆中川芎主要成分的血药质量浓度分析。

洋川芎内酯Ⅰ；藁本内酯；阿魏酸；血药质量浓度；高效液相色谱法

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort的干燥根茎，具有祛风湿、止痛、活血祛瘀功能，主治血瘀气滞的月经不调、闭经、痛经及产后瘀滞腹痛等，也是治疗头痛的要药[1-2]。随着LC/MS、GC/MS等色谱-质谱联用技术的应用，川芎体内成分的检测取得了很大突破[3-6]，对川芎入血成分的研究主要集中在洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸等酚酸类和苯酞类成分[7-11]。由于洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸不仅极性和溶解性差异非常大，而且阿魏酸易异构或分解[12]，导致3种物质的吸收入血后的血样制备方法和HPLC分析方法出现很大差异，通常需要不同的样品制备方法和色谱条件，同一份血浆样本需要分多次检测不同成分，这样重复繁琐的检测方法不利于药代动力学的研究。本实验从含药血浆HPLC的分析方法入手，研究同时检测川芎提取物中3种主要入血成分洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的方法。

1　仪器与试药

1.1仪器Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);SartoriusBP221S型万分之一天平(德国Sartorius公司)；SK-1型快速混匀器(常州澳华仪器有限公司)；超纯水制水机；TGL-20M高速台式低温冷冻离心机(湘仪公司)。

1.2试药阿魏酸对照品、藁本内酯对照品(中国药品生物制品检定研究院，批号分别为110773-201313和110773-201507，质量分数≥99%)；洋川芎内酯Ⅰ对照品(北京嘉世玉禾化工技术研究院，批号为Y-085-151009，HPLC法测质量分数≥98%)；川芎药材，市售，经鉴定，为伞形植物川芎(Ligusticum chuanxiongHort)的干燥根茎；色谱纯：甲醇(美国Fisher公司)；超纯蒸馏水(自制)；甲酸、乙酸乙酯、正己烷和其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent 5 TC-C18(2) (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相A为甲醇，B为2 mL·L-1甲酸水。梯度洗脱(0～9 min，50% A；9～15 min，50%～60% A;15～25 min，60%～75% A)。检测波长：280 nm;流速：0.6 mL·min-1;柱温：室温(25 ℃);进样量：20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1药材提取液称取川芎药材粗粉100g，加入800mL体积分数为75%的乙醇，回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩至100mL，备用。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取洋川芎内酯Ⅰ 5.0mg、藁本内酯4.0mg和阿魏酸2.5mg，分别置于10.0mL棕色量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别制备成洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸对照品溶液，质量浓度分别为500.0,400.0和250.0μg·mL-1。取洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸适量，混匀，用不同量的甲醇稀释至不同质量浓度，制备系列混合对照品溶液。

2.2.3空白血浆加供试品溶液的制备正常SD大鼠取血前禁食12h，自由饮水。眼底丛静脉取血，置于肝素钠采血管内，以8 000r·min-1离心10min，分离上层血浆。取200μL空白血浆+40μL药材提取液，漩涡1min，样品中加入冰乙酸甲醇液50μL，漩涡1min，加入乙酸乙酯正己烷1 000μL，漩涡2min，以8 000r·min-1离心10min，重复萃取2次，取全部上层上清液减压抽干，用200μL甲醇复溶，0.22μm膜过滤，备用。

2.2.4空白血浆加对照品供试品溶液的制备正常SD大鼠取血前禁食12h，自由饮水。眼底丛静脉取血1mL，置于肝素钠采血管内，以8 000r·min-1离心10min，取上清液0.2mL，加入20μL洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸混合对照品溶液，按照2.2.3项下空白血浆供试品溶液制备方法制备样品。按照此方法制得一系列质量浓度的空白血浆加混合对照品的供试品溶液，以及空白血浆加单独对照品的供试品溶液。

2.3方法学考察

2.3.1方法专属性考察及检出限通过对比空白大鼠血浆以及空白血浆加洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸混合对照品的液相色谱图，各液相色谱图见图1，可见该方法对药材成分的检测并无明显干扰，说明该液相条件具有良好的方法专属性。以信噪比为3∶1时各指标成分的浓度作为其检出限，可得洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的检出限分别为1.25，0.50和0.70μg·mL-1。用该色谱方法分析空白血浆加供试品溶液和空白血浆加混合对照品的供试品溶液，见图1。由图1可知，该方法在供试品的血浆检测中也无干扰。

图1HPLC图

a.空白血浆；b.混合对照品；c.样品；1.阿魏酸；2.洋川芎内酯Ⅰ；3.藁本内酯

Fig.1HPLCchromatograms

a.blankplasma;b.plasmaspikedwithfumalicacid，senkyunolideⅠandligustilide；c.plasmasampleafterLigusticum wallichiiadministrated；1.fumalicacid；2.senkyunolideⅠ；3.ligustilide

2.3.2线性范围精密吸取血浆200μL，加入20μL系列质量浓度的洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸混合对照品溶液，制得系列质量浓度供试品溶液。按拟定样品处理方法制备样品，在拟定色谱条件下进样20.0μL，记录峰面积。以对照品质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，以对照品积分面积为纵坐标(Y，A)，进行回归分析，得回归方程及线性范围，见表1。表1空白血浆加对照品溶液线性关系实验结果

Tab.1ThelinearcorrelationresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

对照品名称回归方程r线性范围/μg·mL-1洋川芎内酯ⅠY=27.604X-0.39850.99912.5～250藁本内酯Y=41.287X+19.1370.99962.0～200阿魏酸Y=62.414X-9.63990.99931.25～125

2.3.3精密度实验按照拟定方法制备低、中、高3个质量浓度的空白血浆加对照品溶液，在拟定分析条件下，进样 20.0μL分析。在1d内重复测定6次，求得日内偏差，结果见表2。将上述3个质量浓度的样品分别在6d内连续测定6次，求得日间偏差，结果见表2。结果表明,仪器精密度良好。

按照2.2.3项下空白血浆供试品溶液制备方法制备样品，在拟定分析条件下，进样 20.0μL分析。在1d内重复测定6次，统计样品中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸色谱峰积分面积求得日内偏差，结果洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的日内精密度RSD值分别为2.95%,1.36%和1.59%;样品分别在6d内连续测定6次，求得日间偏差，结果洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的日间精密度RSD分别为2.78%,1.57%和3.42%,结果表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性实验精密量取200.0μL空白血浆18份，平行分为3组，分别加入20.0μL低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，按照拟定处理方法制备样品，在拟定色谱条件下进样分析，其重复性实验RSD值见表2，结果表明，色谱条件重复性良好。

2.3.5稳定性实验取空白血浆样品，加入不同质量浓度的洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸混合对照品溶液，得到低、中、高3个质量浓度的空白血浆加对照品溶液，室温下放置4，6，8，10，12和24h，按照拟定样品制备方法制备样品。在拟定条件下进样 20.0μL分析，通过测定洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的质量浓度变化，考察温度对样品稳定性的影响，实验结果见表3，结果表明稳定性良好。

表2洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸精密度考察结果

Tab.2TheprecisionresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

对照品质量浓度/μg·mL-1日内精密度RSD/%日间精密度RSD/%重复性RSD/%洋川芎内酯Ⅰ12.53.224.623.5050.02.652.171.60250.01.481.561.86藁本内酯10.03.271.673.2940.01.250.992.04200.01.202.431.50阿魏酸6.251.292.292.6125.02.594.263.97125.00.893.861.66

表3洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的稳定性

Tab.3ThestabilityresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

对照品质量浓度/μg·mL-1测得量/×10-3μg4h6h8h10h12h24h平均值/×10-3μgx±sRSD/%洋川芎内酯Ⅰ12.5011.6111.2211.5312.1311.4312.3311.7±0.433.6750.0047.5947.5347.0748.1549.7548.1748.04±0.931.94250.00234.07236.85237.17235.28239.27238.64236.88±1.970.83藁本内酯10.009.979.809.239.729.149.529.06±0.303.9040.0039.1738.9440.1739.6239.2138.8539.32±0.491.27200.00193.97194.58196.85190.03194.81192.4193.77±2.331.71阿魏酸6.256.246.406.426.706.636.656.51±0.182.8625.0023.9923.6323.2524.0922.6922.7523.40±0.613.47125.00119.30117.83114.34117.63113.53113.93113.43±1.013.60

2.3.6提取回收率将20μL的对照品溶液分别加入到200μL的空白血浆和甲醇中，制成低、中、高3个质量浓度的洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸空白血浆样品和洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸甲醇溶液。按照2.2.3项下血浆处理方法制备样品，记录峰面积，以公式Rt=(AX/Ac)×100%计算方法回收率。式中：Rt为提取回收率，AX为血浆指标成分实测峰面积，Ac为甲醇溶液指标成分峰面积。以血浆中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸与甲醇溶液中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的峰面积之比计算提取回收率。结果见表4和表5。

2.3.7方法回收率按照拟定方法制备低、中、高3个质量浓度的空白血浆加对照品溶液，在拟定分析条件下，进样20.0μL。记录峰面积，由洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸线性方程计算得到，由公式R=(AX/AS)×100%计算方法回收率，实验测定数据见表5。式中：R为方法回收率；AX为血浆成分实测峰面积；AS为按标准曲线计算的指标成分峰面积。

2.4结果由考察结果可知，该方法洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的检出限分别为1.25，0.50和0.70μg·mL-1。线性范围分别为2.5～250，2.0～200和1.25～125μg·mL-1，线性范围内3种指标成分线性关系良好；高、中、低3个质量浓度提取回收率和方法回收率均大于80%；精密度、重复性和稳定性实验RSD值均小于10%。由以上数据可知，回收率、精密度、重复性和稳定性等指标均适合生物样品测定要求，表明该方法可用于大鼠血浆中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的分析。

表4洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸提取回收率

Tab.4TheextractionrecoveryrateresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

对照品名称加入量/μg·mL-1血样中测得量/μg·mL-1甲醇中测得量/μg·mL-1平均回收率/%RSD/%洋川芎内酯Ⅰ12.511.57±0.6713.38±0.6586.474.7150.048.57±2.2553.71±2.3190.434.02250.0235.96±1.27266.58±5.4288.513.68藁本内酯10.09.01±0.3610.61±0.5184.923.8440.038.49±0.7142.15±0.5791.321.76200.0194.92±3.14209.82±3.4992.901.45阿魏酸6.256.10±0.126.69±0.1891.182.5125.023.64±1.3425.54±0.4592.563.99125.0115.32±0.99129.08±1.1989.341.85

表5洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸方法回收率

Tab.5ThemethodrecoveryresultsofsenkyunolideⅠ,ligustilideandfumalicacid

对照品加入量/×10-3μg测得量/×10-3μg平均回收率/%RSD/%洋川芎内酯Ⅰ12.511.55±0.8492.403.2150.048.53±0.9397.082.28250.0234.49±3.5593.791.55藁本内酯10.09.38±0.4093.814.2940.039.06±0.4997.661.24200.0195.16±2.8697.581.46阿魏酸6.256.01±0.1296.162.0025.024.07±0.6696.282.75125.0115.90±1.9592.721.68

3　结论

本实验在保证洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸3个指标成分良好的分离度的同时，对样品处理方法和色谱条件进行了系统优化，考察3个样品制备方法制备样品：

方法一：200μL空白血浆+40μL药材提取液，漩涡1min，加入甲醇1 000μL沉淀蛋白，漩涡2min，以8 000r·min-1离心10min，取出上层上清液后，取全部上层上清液减压抽干，用200μL甲醇复溶，0.22μm膜过滤，备用。

方法二：200μL空白血浆+40μL药材提取液，漩涡1min，加入乙酸乙酯-正己烷萃取液1 000μL，漩涡2min，以8 000r·min-1离心10min，取出上层上清液后，原液重复萃取2次，取全部上层上清液减压抽干，用200μL甲醇复溶，0.22μm膜过滤，备用。

方法三：200μL空白血浆+40μL药材提取液，漩涡1min，样品中加入冰乙酸甲醇液50μL，漩涡1min，加入乙酸乙酯正己烷1 000μL，漩涡2min，以8 000r·min-1离心10min，重复萃取2次，取全部上层上清液减压抽干，用200μL甲醇复溶，0.22μm膜过滤，备用。

在拟定分析条件下，进样10.0μL，对比提取效果，由液相色谱图可知，在阿魏酸出峰处差异最显著，其中方法三即本实验选定方案。

其中改进最显著的为对阿魏酸的提取和稳定。阿魏酸在醇溶液中容易异构或分解，在混合萃取剂中也有部分分解，使得液相色谱出现双峰或者肩峰，极大地干扰了积分面积的计算。本实验将提取方法加酸优化后，使用了乙酸乙酯和正己烷的混合萃取剂，使得样品处理方法具有回收率高、灵敏度高、重复性及稳定性良好、且操作简便的特点；液相色谱条件及样品分析时间较短，3种指标性成分均达到良好的分离。表明该方法适合于大鼠血浆中洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯和阿魏酸的含量测定，从而为川芎作用物质基础的研究提供了一种耗时较短、灵敏可靠的样本处理方法和分析手段。

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Simultaneous determination of senkyunolide Ⅰ，ligustilide and fumalic acid of Ligusticum chuanxiong Hort in rats plasma by HPLC

JIANGWei，ZHAOMei，CHENXi，GUOShun，LIUXinyou*

(Department of Pharmacy，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710038，China)

ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationoftheconcentrationofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidinratsplasma.MethodsThreesamplepreparationmethodswerecompared；chromatographicseparationwasaccomplishedusingAgilent5TC-C18(2)(250mm×4.6mm，5μm).Thecolumntemperaturewasatroomtemperature(25 ℃).Themobilephasewascomposedofmethanoland2mL·L-1formicacidinwaterinagradientelutionmode.Theflowratewassetat0.6mL·min-1.Thedetectionwavelengthwassetat280nm.ResultsThesamplepreparationmethodusingethylacetateandn-hexaneforbloodsamplesproducedbetterchromatographicbehavioroftheanalytes.ThegoodlinearrangesofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidwere2.5-250，2.0-200and1.25-125μg·mL-1，respectively.TheaveragerecoveryratesofsenkyunolideⅠ，ligustilideandfumalicacidinthismethodwasmorethan85%；andboththeintradayRSDandtheinterdayRSDwerelessthan4%.ConclusionsThesamplepreparationmethodshowedbettereffectandtheanalyticalmethodforbloodsamplesissimple，rapid，sensitive，reliable，andcanbeemployedforthesimultaneousdeterminationofmajorcomponentsofLigusticum wallichiiinratsplasma.

senkyunolideⅠ；ligustulide；fumalicacid；plasmaconcentration；HPLC

陕西省中医药管理局资助项目(编号：13-ZY039)

姜维，男，药师，硕士研究生

刘新友，男，副主任药师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.007

R945

A

1004-2407(2016)05-0462-05

2015-10-25)