心欣舒胶囊对实验性心肌梗死大鼠的保护作用及机制

申旭霁，常　润，苟　伟，李西宽，孙　强*

(1.西安医学院，西安　710021；2.西安交通大学医学部药学院，西安　710061； 3.西安交通大学医学部基础医学院，西安　710061)



心欣舒胶囊对实验性心肌梗死大鼠的保护作用及机制

申旭霁1,3，常润2，苟伟3，李西宽3，孙强3*

(1.西安医学院，西安710021；2.西安交通大学医学部药学院，西安710061； 3.西安交通大学医学部基础医学院，西安710061)

目的探讨心欣舒胶囊对实验性心肌梗死大鼠心肌的保护作用及冠状动脉新生血管生成的影响。方法采用结扎冠状动脉左前降支的方法制作大鼠心肌梗死模型，观察中成药心欣舒胶囊对实验性心肌梗死大鼠心肌梗死面积及血管生成的影响。建立心肌梗死模型4周后采用Mallory染色检测心肌梗死面积及免疫组化染色测定梗死边缘区血管内皮舒张因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和Ⅷ因子的表达量以及血管面密度。结果心欣舒胶囊大、小剂量治疗组大鼠心肌梗死面积均明显小于模型组，而心肌梗死边缘区VEGF、bFGF和Ⅷ因子的表达量以及血管面密度较对照组均明显增加。结论心欣舒胶囊能减轻实验性心肌梗死大鼠的梗死面积，促进心肌冠脉侧枝循环的生成，对缺血心肌具有保护作用。

心欣舒胶囊； 血管生成；心肌梗死

心欣舒胶囊是临床心内科常用处方，其主要成分为黄芪、地黄、五味子、丹参、赤芍、桂枝和人参茎叶总皂苷等；用于气阴两虚所致的胸痹、心悸以及冠心病、心绞痛、心肌炎属上述证候者[1-2]。本研究采用实验性心肌梗死大鼠模型，研究心欣舒胶囊对心肌梗死大鼠心肌梗死面积及冠脉血管再生的影响及其可能的机制。

1　仪器与材料

1.1仪器BL-420E生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；IX-70荧光倒置显微镜(日本OLYMPLUS有限公司)。

1.2试药心欣舒胶囊(陕西东科制药有限责任公司，批号：140603)；肝素钠注射液(上海第一生化药业有限公司，批号：140601)；重组牛碱性成纤维细胞成长因子(rb-bFGF，贝复济，珠海亿胜生物制药有限公司，批号：20141003)；血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞因子(bFGF)，Ⅷ因子试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3动物健康SPF级8周龄SD大鼠，雄性，体质量200～250g，由西安交通大学实验动物中心提供。

2　方法

2.1动物造模成年SD大鼠用乙醚麻醉，在左侧第4肋间隙钝性分离胸廓，打开胸腔，轻轻挤压暴露心脏，剪开心包后在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2mm处用5号外科手术缝合线结扎冠状动脉左前降支，当缝合线结扎以下心肌变白、搏动减弱且心电图检测ST段弓背向上抬高则为造模成功[3]。造模当天开始每天肌注青霉素1次(20万u)，共3d。

2.2实验分组及给药大鼠造模成功后将存活的大鼠47只分为5组:心欣舒小剂量组(1组)、心欣舒大剂量组(2组)、阳性对照组(3组)、模型组(4组)、假手术对照组(5组)，每组8～10只，分别按照下述方法给药。心欣舒大、小剂量组在心梗造模后开始分别每天给予心欣舒(心欣舒胶囊成人用量为每日口服6.0g，按照体表面积换算成大鼠剂量)0.625和1.25g·kg-1(加入生理盐水制成2mL的混悬液)灌胃给药，持续4周。阳性对照组在开胸结扎冠脉后给予结扎喷洒rb-bFGF1揿(125AU)，并于术后每天皮下注射普通肝素 1 250u·kg-1，共5d；模型组为不给药组，造模后每天给予2mL生理盐水灌胃，共4周。假手术组开胸后不结扎冠脉，仅用外科缝针空穿1次即缝合胸壁。4周后处死动物，取心脏标本放入体积分数为15%的福尔马林中固定备用。

2.3苏木素-伊红(H-E)染色及Mallory三色染色心肌标本固定后常规脱水、透明、石蜡包埋、切片后免疫组化H-E染色及Mallory染色，在光镜下观察实验各组心肌坏死及胶原纤维形成情况。采用ImageJ细胞图像分析软件分别测定心肌梗死面积和心室总面积，梗死面积(%)=心肌梗死面积/总面积×100%。

2.4心肌梗死边缘区血管面密度测定免疫组化心肌组织Ⅷ因子染色，ImageJ细胞图像分析软件测量左室梗死边缘区Ⅷ因子阳性染色血管数，选择梗死区周围血管密度最高的5个区域，并计数血管数目，每份标本取计数平均值，以平均微血管数/mm2表示微血管面密度(200×高倍视野等于0.042 6mm2)。2.5心肌梗死边缘区VEGF、bFGF及Ⅷ因子表达量的测定心肌组织按照标准流程免疫组化染色，具体步骤见博奥森公司试剂盒操作说明。染色后采用细胞图像分析系统对VEGF、bFGF和Ⅷ因子进行定量分析。计算阳性区域所占总面积，每张切片随机选3个视野取平均值。

3　结果

3.1苏木素-伊红染色(H-E染色)H-E染色在心肌梗死大鼠左心室可见一定范围的缺血坏死区心肌纤维溶解断裂，心肌纤维横纹消失、肿胀，心肌细胞胶原纤维及部分心肌核溶解消失，可见轻度炎细胞浸润，缺血区有心肌纤维化形成，梗死区内外两侧尚有部分存活心肌。见图1。

图1苏木素-伊红染色(HE×200)

A.假手术组；B.模型组

Fig.1Hematoxylin-eosinstain(HE×200)

A.shamoperationgroup；B.modelgroup

3.2心欣舒对心肌梗死区梗死范围的影响显微镜下Mallory染色心肌纤维组织呈红色，而胶原纤维呈蓝色，见图2。各组梗死面积结果见表1。由表1可知，心欣舒大、小剂量组及肝素组梗死面积均较模型组明显减少，心欣舒小剂量组与肝素组比较心肌梗死面积无明显差异(P>0.05)，而心欣舒大剂量组与肝素组比较心肌梗死面积减少(P<0.05)。

图2Mallory三色染色

A.假手术组；B.模型组；C.肝素组；D.心欣舒大剂量组；E.心欣舒小剂量组

Fig.2Mallory′strichromestain

A.shamoperationgroup；B.modelgroup；C.heparingroup；D.highdosegroupofXinxinshuCapsules；E.lowdosegroupofXinxinshuCapsules

表1心欣舒对心肌梗死大鼠左室梗死面积的影响

注：与模型组比较aP<0.05，dP<0.01；与肝素组比较bP<0.05；与心欣舒小剂量组比较cP<0.05。-表示未给药或用生理盐水灌胃。

3.3心肌梗死边缘区血管面密度检测镜下给药组可见较多微小血管均匀分布在心肌组织，给药组与模型组比较有明显差异(P<0.01)；心欣舒组与肝素组比较血管生成增多(P<0.01)；心欣舒大、小剂量组血管密度有明显差异(P<0.01)。见表2。

表2心欣舒对心肌梗死边缘区血管面密度的影响

注：与模型组比较aP<0.01；与心欣舒小剂量组对比bP<0.01；与肝素组比较cP<0.01。-表示未给药或用生理盐水灌胃。

3.4心肌梗死大鼠左室梗死边缘区VEGF、bFGF和Ⅷ因子表达量镜下VEGF和bFGF阳性染色区域呈棕黄色，弥散分布于心肌细胞与间质，而Ⅷ因子阳性染色区域则位于血管内皮细胞内。给药组阳性染色区域面积较模型组明显增加(P<0.01)；而心欣舒大、小剂量组阳性染色面积具有明显差异，心欣舒小剂量组与肝素组阳性面积差异不明显(P>0.05)。见表3。

表3心欣舒对左室梗死边缘区VEGF、bFGF和Ⅷ因子表达量的影响

Tab.3EffectofXinxinshuCapsulesontheexpressionsofVEGF，bFGFandⅧintheedgeofinfarctsection(μm2)

组别动物数/只剂量VEGFbFGFⅧ因子 假手术组9—21056±291.7a23420±211.6a20819±361.7a模型组10—25741±206.127040±311.225793±452.2肝素组81250u·kg-133274±336.0a35273±204.2a34160±293.6a心欣舒小剂量100.625g·kg-135038±348.1a36081±231.7a36742±735.3a心欣舒大剂量101.250g·kg-140752±424.8ab43693±362.4ab43207±235.5ab

注：与模型组比较aP<0.01，与心欣舒小剂量组比较bP<0.05；-表示未给药或用生理盐水灌胃。

4　讨论

心肌梗死是临床常见的、威胁人们生命健康的心血管疾病，其主要是由于冠状动脉供血不足引起的心肌缺血、缺氧及心肌坏死，临床治疗主要以尽快恢复患者心肌血液的灌注、减小心肌缺血的范围和避免梗死范围扩大等为主[1]。心欣舒胶囊主要由人参茎叶总皂苷和黄芪等组成，可明显改善胸闷、心悸和气短等症状[1-2]。现代药理学研究证实，人参茎叶总皂苷和黄芪具有强心和保护心肌的作用，增强心肌收缩、减慢心率、增加心输出量和冠脉血流量[4-5]，对心肌缺血缺氧和再灌注损伤等具有明显保护作用，其中丹参和赤芍可改善血液循环，抑制血小板聚集，抗动脉粥样硬化[6-8]；桂枝具有扩张冠状动脉、增加微小血管和冠脉血流量的作用。这些均对冠心病、心绞痛的发生、发展有积极的预防和治疗作用[1]。本研究通过免疫组织化学方法检测心肌梗死大鼠心肌内皮细胞Ⅷ因子的表达，计算梗死灶及边缘区的微血管密度，结果表明，心欣舒胶囊能显著增加梗死边缘区的血管面密度 (P<0.05)，其作用随药物的剂量增加而有加强趋势。阳性对照组采用的rb-bFGF/肝素，是已知的有明确促进血管新生的药物，而血管生长因子(VEGF和bFGF等)可促进梗死周围心肌组织血管新生[9]，研究发现，一些中药有降低梗死面积和促进血管新生的作用[10]。实验表明，心欣舒胶囊能显著减少心肌梗死大鼠的心肌梗死面积，增加梗死边缘区血管生长因子(VEGF，bFGF)的表达量，增加梗死边缘区血管面密度。尽管缺血性心脏病患者存在自发形成侧支循环的趋势，但其速度与程度均不足以代偿机体的需要，而血管再生性治疗可促进形成和开放冠脉侧支循环，为缺血心肌提供新的血液供应[10]。因此，心欣舒胶囊有促进心肌缺血区血管生成的作用，并通过此作用保护缺血心肌，从而减少心肌梗死面积。

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Protective effect and mechanisms of Xinxinshu Capsules on experimental myocardial infarction in rats

SHEN Xuqi1,3，CHANG Run2，GOU Wei3，LI Xikuan3，SUN Qiang3*

(1.Xi′anMedicalSchool，Xi′an710021，China；2.SchoolofPharmacy，Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an710061，China；3.SchoolofBasicMedicalSciences，Xi′anJiaotongUniversityofMedicine，Xi′an710061，China)

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsofXinxinshuCapsulesonexperimentalmyocardialinfarctioninratsinducedbyleftanteriordescendingbranchofcoronaryartery.MethodsLeftanteriordescendingcoronaryarteriesofratswereligatedtoproduceacutemyocardialinfarctionmodel.ImmunohistochemistywasusedtodetectthecontentsofVEGF，bFGF，Ⅷfactorandvasculardensityintheedgeofinfarctsection，andtheinfarctareawasmeasured.ResultsTheinfarctareasintreatmentgroupswereobviouslylessthaninmodelgroup.ThecontentsofVEGF，bFGFandⅧfactorintheedgeofinfarctsectionandvasculardensityintreatmentgroupsweresignificantlyincreasedcomparedwiththoseinmodelgroup.ConclusionXinxinshuCapsulescandecreasetheinfarctareaandstimulateangiogenesisofthecollateralbranchofcoronaryarteryinischemicmyocardiumofrats，andshowedgoodprotectiveeffectonmyocardialischemia.

XinxinshuCapsules；angiogenesis；myocardialinfarction

申旭霁，男，硕士,讲师

孙强，男，副教授，硕士研究生导师

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.015

R965

A

1004-2407(2016)05-0489-04

2015-12-10)