马钱子减毒总生物碱的制备及毒性

王冬月，　陈 军，　董 洁，　陆姗姗，　蔡宝昌

（1.南京中医药大学药学院，江苏　南京　210023；2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏　南京　210023；3.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏　南京　210023；4.国家中医药管理局中药炮制标准重点研究实验室，江苏　南京　210023；5.南京海昌中药集团，江苏　南京　210061）

马钱子减毒总生物碱的制备及毒性

王冬月1，2，3，4，5，陈 军1，2，3，4，董 洁1，陆姗姗1，蔡宝昌2，3，4，5*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210023；3.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏南京210023；4.国家中医药管理局中药炮制标准重点研究实验室，江苏南京210023；5.南京海昌中药集团，江苏南京210061）

目的 制备去除大部分士的宁的马钱子减毒总生物碱，并考察马钱子总生物碱减毒前后成分及毒性的变化。方法 用不同体积分数的乙醇溶解马钱子总生物碱，经磁力搅拌、离心后制备得到马钱子减毒总生物碱，HPLC法测定马钱子减毒总生物碱中马钱子碱和士的宁的量。用Q-TOF-MS技术比较鉴定了马钱子总生物碱减毒前后的主要生物碱类成分。通过小鼠口服急性毒性试验考察了马钱子总生物碱减毒前后的毒性变化情况。结果 以20%乙醇为溶剂制备的马钱子减毒总生物碱去士的宁效果最好，同时不影响其他19种生物碱类含有量。小鼠口服急性毒性LD50实验表明马钱子减毒总生物碱与马钱子总生物碱的LD50分别为31.08 mg/kg、10.92 mg/kg。结论 马钱子总生物碱中士的宁占38.49%，减毒后仅占14%，减毒工艺提高了马钱子总生物碱临床使用的安全性。

马钱子总生物碱；马钱子减毒总生物碱；乙醇；HPLC；LC-MS/MS；急性毒性试验

马钱子又名番木鳖，为马钱子科植物马钱Strychons nuxvomica L.的干燥成熟种子。具有通络止痛，散结消肿之功效［1］。马钱子的主要有效且有毒部位是总生物碱，马钱子碱与士的宁占其绝大部分，而马钱子碱的毒性是士的宁的1/20～1/40［2］。文献表明，士的宁在镇痛［3-4］及抗炎、治疗风湿方面无效［5］。而马钱子总生物碱却有明显的效果。因此设想如能去除马钱子总生物碱中的士的宁，就可以在保留药效的基础上降低毒性，提高临床用药的安全性。本实验利用马钱子总生物碱溶于20%乙醇时，其中的马钱子碱与士的宁溶解度相差最大的机制，经磁力搅拌、离心后去除马钱子总生物碱中的士的宁，得到马钱子减毒总生物碱。并采用Q-TOF-MS技术对马钱子总生物碱与马钱子减毒总生物碱中的生物碱类成分进行分析，最终通过小鼠口服急性毒性试验比较两者的毒性。

1　材料

1.1药品与试剂 制马钱子（批号20110517），浙江中医药大学中药饮片厂，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为马钱子科植物马钱Strychons nuxvomica L.的干燥成熟种子；马钱子碱、士的宁（美国Sigma公司）。庚烷磺酸钠（山东禹王实业有限公司禹城化工厂，批号2009041503）；磷酸二氢钾（上海久亿化学试剂有限公司，批号20030801）；质谱纯乙腈（德国Merck公司）；其余试剂皆为分析纯。

1.2仪器 LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津公司），UFLC/Q-TOF-MS（LC-MS-Trip1e TOFTM5600+，AB SCIEX，美国），TGL-20bR高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），BT25S电子天平（德国Sartorius公司），PHS-3C PH计（上海康仪仪器有限公司），TK-12D透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司），DZF-6020真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），KH-100DE超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.3动物 ICR小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，南通大学动物实验中心提供。合格证号：SCXK（苏）2008-0010。

2　方法与结果

2.1马钱子总生物碱的制备 马钱子碱及士的宁分别在制马钱子中占1.04%（n=5）、1.68%（n= 5），符合《中国药典》规定。精密称取200 g制马钱子粉末（过50目筛），用15倍量70%乙醇加热回流提取3次，每次0.5 h，过滤，合并3次滤液，旋转蒸发浓缩至干。得到马钱子总生物碱粗提物，得率为17.13%（n=3）。用1 mo1/L的盐酸20 mL超声溶解，4 000 r/min离心10 min，取上清液，40%的氢氧化钠调pH至12.0。用二氯甲烷萃取合并，真空干燥除去二氯甲烷，得到马钱子总生物碱，精密称定质量，得率为（2.74±0.31）%（n=5）。用酸性染料比色法［6］测得马钱子总生物碱的纯度为（以马钱子碱计）（98.93±0.002）%（n=3）。

2.2马钱子减毒总生物碱制备工艺考察

2.2.1色谱条件［1］Purospher STAR RP-18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-［0.01 mo1/L庚烷磺酸钠-0.02 mo1/L磷酸二氢钾等量混合（用10%磷酸调pH至2.8）］（21∶79）；体积流量0.8 mL/min；检测波长264 nm；柱温30℃；进样量10μL。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取马钱子碱、士的宁对照品10 mg，用甲醇溶解、稀释，得到质量浓度为0.1 mg/mL的马钱子碱和士的宁对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称定马钱子减毒总生物碱固体物10 mg，用甲醇溶解、稀释，得到质量浓度为32μg/mL的供试品溶液。

2.2.4标准曲线的制备 精密吸取一定体积的马钱子碱和士的宁对照品溶液，用甲醇稀释得到质量浓度分别为0.52、1.04、2.08、4.16、8.32、16.64μg/mL的标准溶液，HPLC进样，得到峰面积。以质量浓度（Ⅹ）对峰面积（Y）作线性回归，分别得到马钱子碱和士的宁的回归方程。马钱子碱的回归方程为Y=21 483Ⅹ+3 447.6（r=0.999 9）；士的宁的回归方程为Y=25 460Ⅹ+2 128.5（r= 0.999 9），马钱子碱与士的宁质量浓度在0.52～16.64μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5马钱子总生物碱的测定 精密称定马钱子总生物碱固体物20 mg，用甲醇溶解、稀释，得到质量浓度为32μg/mL的供试品溶液。HPLC法测定其中马钱子碱和士的宁的量，马钱子碱占马钱子总生物碱的21.80%，士的宁占马钱子总生物碱的38.49%（n=3）。

2.2.6乙醇体积分数考察 精密称取5份1 g的马钱子总生物碱粉末，依次放入装有1 mL 10%、20%、30%、40%、50%乙醇的西林瓶中。30℃超声5 min（功率600 W，频率40 kHz）。封口膜密封，于30℃水浴下磁力搅拌（500 r/min）12 h。分别将溶液转移至离心管中，12 000 r/min高速离心3 min，吸取上清液。并置65℃真空干燥箱中干燥12 h，得固体物，即马钱子减毒总生物碱，精密称定并计算固体物得率。精密称取一定量的马钱子减毒总生物碱固体物，甲醇定容并稀释。HPLC测定其中马钱子碱和士的宁的量。测定结果见表1。由表1结果可知，用20%乙醇溶解马钱子总生物碱，其中的马钱子碱和士的宁的溶解度相差最大，制得马钱子减毒总生物碱，其中的马钱子碱和士的宁的含有量相差最大。

表1　不同体积分数乙醇制备得到的马钱子减毒总生物碱，其中马钱子碱与士的宁的量（±s，n=3）Tab.1 Content of brucine and strychnine in MTAF under different concentrations of ethanoI（±s，n=3）

乙醇体积分数/%固体物得率/%马钱子碱/（μg·mL-1）士的宁/（μg·mL-1）马钱子碱/士的宁10 34.08 161.40 68.98 2.34±0.002 20 34.30 161.25 63.50 2.54±0.086 30 35.72 159.75 66.11 2.42±0.074 40 33.54 156.46 75.78 2.06±0.015 50 34.64 142.32 68.94 1.93±0.008

2.2.7马钱子总生物碱的加入量考察 为考察除乙醇体积分数外的其他因素对马钱子减毒总生物碱中马钱子碱和士的宁的影响，向确定的溶剂中加入不同量的马钱子总生物碱。精密称取0.125 g、0.25 g、0.5 g、1 g马钱子总生物碱粉末，依次放入4个装有1 mL 20%乙醇的西林瓶中。其余操作同“2.2.6”项下，结果见表2。由表2结果可知，其他条件相同时，在1 mL的20%乙醇中加入0.25 g马钱子总生物碱，制得马钱子减毒总生物碱，其中的马钱子碱和士的宁含有量相差最大。

2.2.8放大工艺考察 为提高效率，适应大规模生产，考察了去士的宁工艺成比例放大的可行性。精密称取0.25 g、0.5 g、1 g、2 g马钱子总生物碱粉末，依次放入装有20%乙醇1 mL、2 mL、4 mL、8 mL的西林瓶中。其余操作同“2.2.6”项下，结果见表3。由表3可知，将去士的宁规模放大，即将2 g马钱子总生物碱加入8 mL 20%的乙醇中得到的马钱子减毒总生物碱，其中的马钱子碱和士的宁含有量相差最大。

表2　马钱子总生物碱不同加入量，制备得到马钱子减毒总生物碱，其中马钱子碱和士的宁的量（±s，n=3）Tab.2 Content of brucine and strychnine in MTAF under different added amount of TAF（±s，n=3）

表2　马钱子总生物碱不同加入量，制备得到马钱子减毒总生物碱，其中马钱子碱和士的宁的量（±s，n=3）Tab.2 Content of brucine and strychnine in MTAF under different added amount of TAF（±s，n=3）

马钱子总生物碱加入量/g固体物得率/ %马钱子碱/（μg·mL-1）士的宁/（μg·mL-1）马钱子碱/士的宁（±s）0.125 28.50 152.26 56.87 2.68±0.028 0.25 34.30 156.61 56.79 2.76±0.043 0.5 32.16 154.99 56.32 2.75±0.042 1 34.30 162.48 63.72 2.55±0.013

表3　不同规模的工艺，制得马钱子减毒总生物碱，其中马钱子碱和士的宁的量（±s，n=3）Tab.3 Content of brucine and strychnine in MTAF under different scaIe（±s，n=3）

表3　不同规模的工艺，制得马钱子减毒总生物碱，其中马钱子碱和士的宁的量（±s，n=3）Tab.3 Content of brucine and strychnine in MTAF under different scaIe（±s，n=3）

马钱子总生物碱加入量/g溶剂体积/m L固体物得率/%马钱子碱/（μg·mL-1）士的宁/（μg·mL-1）马钱子碱/士的宁0.25 1 34.30 149.31 58.89 2.53±0.061 0.5 2 36.90 154.47 56.82 2.72±0.006 1 4 38.26 154.16 55.00 2.80±0.009 2 8 38.59 147.69 47.38 3.12±0.020

2.2.9结果 根据上述结果，马钱子减毒总生物碱的制备工艺可以确定为：将2 g马钱子总生物碱加入装有8 mL 20%乙醇的西林瓶中，30℃超声5 min。封口膜密封，于30℃水浴下磁力搅拌（500 r/min）12 h。分别将溶液转移至离心管中，12 000 r/min高速离心3 min，吸取上清液。置65℃真空干燥箱中干燥12 h，所得固体物即马钱子减毒总生物碱，得率约38.59%（n=3）。马钱子减毒总生物碱中马钱子碱与士的宁的含有量比可以达到约3.12∶1（n=3）。

2.3马钱子总生物碱减毒前后的成分分析

2.3.1色谱条件 Agi1ent ZORBAX Ec1ipse P1us C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5μm）；柱温30℃；流动相为0.3%甲酸水溶液（A）-甲醇溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～20%B；5～13 min，20%～25%B；13～25 min，25%～50%B）；体积流量0.4 mL/min；进样量1μL。

2.3.2质谱条件 采用ESI离子源；在正离子模式下采集数据，数据采集范围：m/z100～800。各项参数设置：雾化气（Gas 1）55 Pa；辅助气（Gas 2）55 Pa；气帘气（CUR）35 Pa；离子源温度（TEM）550℃；喷雾电压（SVF）5 500 eV；去簇电压（DP）60 eV；碰撞电压（CE）50 eV；碰撞电压差（CES）15 eV。样品进样之前进行分子量校正。实验数据采用Peakview软件（1.2）处理。

2.3.3供试品溶液的制备 精密称取马钱子总生物碱及马钱子减毒总生物碱粉末各10 mg，用甲醇溶解并稀释，得到质量浓度为40μg/mL的马钱子总生物碱、马钱子减毒总生物碱的供试品溶液。进样前经0.22μm滤膜滤过。

2.3.4结果 利用UFLC/Q-TOF-MS得到减毒前后马钱子总生物碱中各生物碱类成分的母离子及碎片离子的精确质量信息，结合文献［7-11］，对马钱子总生物碱及马钱子减毒总生物碱中的生物碱成分进行了结构推测。图1为马钱子总生物碱溶液及马钱子减毒总生物碱溶液总离子流图，图2～图4为马钱子减毒总生物碱中主要成分的MS2图及推测裂解途径举例。马钱子碱总生物碱减毒前后检测到19种相同的生物碱类成分，见表4。

图1　马钱子总生物碱溶液（A）与马钱子减毒总生物碱溶液（B）正离子模式下的总离子流图Fig.1　Representative chromatogram s for the totaIaIkaIoid fraction from nux-vom ica and themodified totaIaI-kaIoid fraction in positive ion mode

图2　马钱子碱的MS2图及裂解途径Fig.2　MS2spectra and proposed fragmentation of brucine

图3　士的宁的MS2图及裂解途径Fig.3　MS2spectra and proposed fragmentation of strychnine

图4　伪番木鳖碱的MS2图及裂解途径Fig.4　MS2spectra and proposed fragmentation of pseudostrychnine

表4　马钱子总生物碱及马钱子减毒总生物碱溶液Q-TOF-MS数据及成分鉴定Tab.4 Identification resu Its of TAF and M TAF by Q-TOF-MS

2.4 马钱子总生物碱与马钱子减毒总生物碱口服极性毒性试验 对马钱子总生物碱和马钱子减毒总生物碱进行小鼠口服急性毒性试验研究。通过试验可以了解两者的毒性程度，预测药物的安全性。

2.4.1溶液的配制 取马钱子总生物碱、马钱子减毒总生物碱适量，精密称定，置量瓶中，用PBS溶解。

2.4.2实验方法 经过预试验后得到马钱子总生物碱、马钱子减毒总生物碱溶液的Dn（0%致死量）与Dm（100%致死量）。两组药均选择4个剂量，用“低比稀释法”配置药液。实验选用ICR小鼠80只，雌雄各半，体质量18～22 g。将两种药分别分成4组，每组10只动物。实验前禁食12 h（不禁水）。按每10 g体质量0.2 mL剂量给小鼠灌胃。实验结束后用“改良寇式法”计算小鼠的半数致死量LD50及其95%可信限。最终计算得马钱子总生物碱的LD50为10.92 mg/kg，LD50的95%可信限为10.91～13.35mg/kg。马钱子减毒总生物碱的LD50为31.08 mg/kg，LD50的95%可信限为23.56～38.56 mg/kg。

3　讨论

通过考察，确定了马钱子总生物碱减毒（去士的宁）的最优工艺。即以20%乙醇为溶剂，将一定量的马钱子总生物碱，经磁力搅拌、离心及干燥后制备得到马钱子减毒总生物碱。马钱子生物碱中士的宁占38.49%，马钱子碱占21.80%。去士的宁后马钱子减毒总生物碱中士的宁占14%，马钱子碱占42.91%。士的宁的比例相对提高，证明去除了绝大部分的士的宁。利用先进的分析仪器LC-MS-Trip1e TOFTM5600+分析马钱子总生物碱和马钱子减毒总生物碱，推测鉴定得到19种相同的生物碱类成分。小鼠的口服急性毒性试验揭示了马钱子总生物碱及马钱子减毒总生物碱均有毒性，而马钱子减毒总生物碱的毒性较马钱子总生物碱的毒性下降了约3倍。可见，士的宁是马钱子总生物碱中的主要毒性成分。证明了马钱子总生物碱的减毒（去士的宁）工艺在去除了绝大部分毒性成分的同时，确保主要的成分组成不发生变化。

必须指出的是，此前，采用50%乙醇为溶剂从马钱子碱总生物碱中去除士的宁，其依据是马钱子碱与士的宁单体在50%乙醇中的溶解度相差最大［12］。但是，进一步的研究发现，这两种成分在总生物碱中的溶解度与单体时完全不同，因此本实验采用测定其在总生物碱中的溶解度来确定最佳乙醇体积分数。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：46.

［2］陈海英，陆 红.马钱子治疗风湿性关节炎研究进展［J］.中国中医药科技，2000，10（6）：373-375.

［3］Yin W，Wang T S，Yin F Z，et al.Ana1gesic and anti-inf1ammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnos nux-vomica［J］.J Ethnopharmacol，2003，88（2/3）：205-214.

［4］朱燕娜，鲍梦周，曹永舒，等.马钱子碱和士的宁镇痛作用的初步探讨［J］.河南医科大学学报，1989，24（4）：287-292.

［5］魏世超，徐丽君，张秀桥，等.马钱子总生物碱对实验性关节炎的影响［J］.医药导报，2002，21（6）：335-336.

［6］陈 军，蔡宝昌，沈春云，等.马钱子总生物碱的含量测定［J］.中药新药与临床药理，2007，18（6）：468-471.

［7］Yan J，Liu Z，Yan C，et al.Ana1ysis of strychnos a1ka1oids using e1ectrospray ionization fourier transformion cyc1otron resonance mu1ti-stage tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20（8）：1333-1335.

［8］Stah1R S，Arjo W M，Wagner K K，et al.Deve1opment of a high performance 1iquid chromatography/mass spectroscopy method for the determination of strychnine concentrations in insects used to assess potentia1risks toinsectivores［J］.JChromatogr B，2004，811（2）：257-261.

［9］Choi Y H，Sohn Y M，Kim C Y，et al.Ana1ysis of strychnine from detoxified Strychno nux-vomica seeds using 1iquid chromatography-e1ectrospray mass spectrometry［J］.J Ethnopharmacol，2004，93（1）：109-112.

［10］Xu Y Y，Si D Y，Liu C X，et al.Determination of strychnine and brucine in rat p1asma using 1iquid chromatography e1ectrospray ionization mass spectrometry［J］.J Pharmaceut Biomed，2009，49（20）：487-491.

［11］Tian JX，Peng C，Xu L，et al.In vitro metabo1ism study of Strychnos a1ka1oids using high-performance 1iquid chromatography combined with hybrid ion trap/time-of-f1ightmass spectrometry［J］.Biomed Chromatogr，2012，27（6）：775-783.

［12］高 颖，优化马钱子总生物碱的制备及药效学研究［D］.南京：南京中医药大学，2010：72.

Preparation and toxicity of Iow-strychnine totaIaIkaIoids from Strychni Semen

WANG Dong-yue1，2，3，4，5， CHEN Jun1，2，3，4， DONG Jie1， LU Shan-shan1， CAIBao-chang2，3，4，5
（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing，Nanjing 210023，China；3.Engineering Center for Standardization of ChineseMedicine Processing，Ministry of Education，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；4.Key laboratory for Standardization ofChineseMedicine Processing，State Administration of Traditional ChineseMedicine，Nanjing 210023，China；5.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Corporation，Nanjing 210061，China）

AIM To prepare the 1ow-strychnine tota1a1ka1oids from Strychni Semen and to ana1yze the changes of their chemica1 constituents and toxicity.METHODS Different concentrations of ethano1so1ution as extraction so1vents，magnetic stir and centrifuga1separation were used to attenuate the strychnine content.The determination of brucine and strychninewas performed by HPLC，and Q-TOF-MSsystem was app1ied to the identification of other a1ka1oids.At the same time，the toxicity changes before and after attenuation were exp1ored by use of acute toxicity experiment ofmice.RESULTS 20%ethano1 did the best to 1ower strychnine content and did no harm to the contents of other nineteen constituents.The acute toxicity data showed that the LD50ratio ofwithout attenuation and

tota1a1ka1oids from Strychni Semen；1ow-strychnine tota1a1ka1oids from Strychni Semen；ethano1；HPLC；LC-MS/MS；acute toxicity

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0168-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.036

2013-12-21

王冬月（1987—），女，硕士，研究方向：中药新剂型与药物动力学。E-mai1：wangdongyue19871208@126.com

蔡宝昌（1952—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药炮制规范化与标准。Te1：（025）85811112，E-mai1：bccai@126.com

with attenuation was 31.08 mg/kg vs 10.92 mg/kg.CONCLUSION Attenuation can effective1y make the remova1of strychnine from 38.49%to 14%and guarantee the c1inic security of Strychni Semen.