铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

刘亚娟，　吴江林，　王诗豪，　张 铭，　华允芬

（1.浙江工业大学药学院，浙江　杭州　310012；2.浙江省农药检定管理所，浙江　杭州　310020；3.浙江大学生命科学学院，浙江　杭州　310058）

铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响

刘亚娟1，3，吴江林2，王诗豪3，张 铭3，华允芬1*

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310012；2.浙江省农药检定管理所，浙江杭州310020；3.浙江大学生命科学学院，浙江杭州310058）

目的 研究铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响。方法 采用水提醇沉法对铁皮石斛进行初步提取，体外培养小鼠胚胎干细胞，通过克隆形成率试验、MTT试验及实时定量PCR的方法研究铁皮石斛提取多糖对小鼠胚胎干细胞的增殖及多能性维持的作用。结果 铁皮石斛多糖处理组细胞（50～200μg/m L）的克隆形成率、MTT吸光度值均高于空白对照组，同时其干性相关基因的表达量与对照组相比无显著差异。结论 铁皮石斛多糖可以显著促进小鼠胚胎干细胞的增殖、提高其克隆形成率，同时又不影响其多潜能性的维持。

铁皮石斛；多糖；小鼠胚胎干细胞；增殖

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo.系兰科石斛属多年生草本植物，别名“黑节草”，是我国传统名贵中药，因其滋阴清热、益胃生津等功效而享有“民间仙草、植物黄金”的美誉［1］。自1932年以来，国内外学者对石斛属多种植物进行了化学成分研究，从中分离鉴定出生物碱类、多糖类、倍半萜类、菲醌类、联苄类、芴酮类、甾体类、酚类及挥发油等多种活性成分［2-3］。胚胎干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能［4］。胚胎干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透，具有广泛的应用前景，如：用于组织移植、器官修复［5］；细胞治疗、基因治疗［6］及药物筛选和开发［7］等。目前对植物多糖的生物活性和功能已有较多研究，如免疫调节［8-9］、抗氧化［10］、抗衰老［11］、抗癌［12-13］、抗菌［14］、降血糖［15］等，但铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞的作用药效在国内外尚未见其相关报道，本实验对此进行了相关的探索研究。

1　材料

1.1仪器 PRISM®7900HT荧光定量PCR仪（ABI公司）；SynergyTMH1全能酶标仪（Bio Tek公司）；核酸蛋白测定仪（Eppendorf公司）；CO2细胞培养箱（Thermo Forma公司）；ECLIPSETS100倒置相差显微镜（Nikon公司）；YJ-1450医用净化工作台（苏州金燕净化设备厂公司）；HIMAC高速离心机（Hitachi公司）；冷冻干燥机（FD-1A-50，Bi1on公司）；Cryo 1℃程序细胞冻存盒（Na1gene Labware公司）。

1.2细胞株 小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryo fibrob1asts，MEF）取自妊娠13.5 d的ICR小鼠，所用小鼠购于浙江省医学科学院；小鼠胚胎干细胞（Mouse embryonic stem ce11s，MES）细胞系D3由中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物研究所惠赠。

1.3试药 铁皮石斛全草购于浙江台州铁皮石斛种植基地，经浙江大学生命科学学院张铭教授鉴定为铁皮石斛Dendrobium officinale。

噻唑蓝（MTT）、丝裂霉素C、二甲基亚砜（DMSO）、乙二胺四乙酸二钠钙（EDTA）、明胶、碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒均购自Sigma公司；高糖DMEM培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青生物公司；胰蛋白酶购于Hyc1one公司，Trizo1购于Invitrogen公司；REVER Tra Ace©qPCR RT Kit和THUNDERBIRD SYBR© qPCR Mix购于TOYOBO公司。

2　方法

2.1铁皮石斛多糖的提取 取新鲜的铁皮石斛全草适量，清水洗涤除去杂质，100℃杀青后于60℃烘箱中烘干、粉碎，过60目筛，取其干燥粉末。用传统水提醇沉法［16］提取铁皮石斛粗多糖。所提粗多糖用Sevage法脱蛋白：加入1/5倍体积三氯甲烷-正丁醇（4∶1）混合液剧烈振摇20～30 min，3 000 r/min离心5 min，分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质，重复4～5次；旋转蒸发仪减压浓缩、醇析、冷冻干燥得铁皮石斛多糖。

2.2铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞克隆形成率的影响 丝裂霉素C处理后的MEF按5.0×104个/孔的密度接种到24孔板中作为饲养层；取对数生长期的D3细胞，用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以每孔500个细胞的密度种到饲养层上，加入终质量浓度分别为0（对照）、25、50、100、200、400μg/mL的铁皮石斛多糖完全培养液，每个质量浓度做4个重复，37℃5%CO2条件下培养3～4 d后用碱性磷酸酶试剂盒按说明书步骤进行ALP染色，在相差显微镜下观察D3细胞克隆染色情况并计数分析。

2.3铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞增殖的影响

将对数生长期的D3细胞消化计数后，以4.0×103个/孔的细胞密度接种到0.5%明胶包被的96孔板中。培养24 h后更换成含铁皮石斛多糖质量浓度分别为0（对照）、25、50、100、200、400 μg/mL的完全培养液，每个多糖质量浓度做4个重复，并做只加培养液的空白孔。继续培养24、48、72 h后的细胞按已报道方法［17］进行MTT染色，在490 nm下用酶标仪测定各孔吸光值。以各个样品组的吸光度值减去空白对照孔的吸光度值作为各组真实的吸光度值以反映细胞的增殖水平。

2.4铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞多潜能性的影响 丝裂霉素C处理后的MEF按4.0×105个/孔的密度接种到6孔板中作为饲养层；按2.0× 104个/孔的细胞量接种对数生长期的D3细胞到饲养层上，培养24 h后换成含铁皮石斛多糖的培养液（终质量浓度分别为0、50、100、200、400 μg/mL）。每个质量浓度做3个重复，每天换液。继续培养72 h后，收集细胞，用Trizo1提取RNA后用REVER Tra Ace®qPCR RT Kit逆转录为cDNA，之后以β-actin为内参，实时荧光定量PCR（qPCR）检测小鼠胚胎干细胞干性相关基因Nanog、Oct4、Sox2、K1f4、Lin28、Rex1和Aire［18］的相对表达量。

2.5统计学处理 应用SPSS 20软件对实验数据进行分析，各变量均以实验组±s表示，组间比较采用t检验，应用Origin 8.0软件对实验结果进行绘图分析。

3　结果

3.1铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞克隆形成率的影响 克隆形成率试验结果显示，铁皮石斛多糖的质量浓度在50～200μg/mL时可以提高小鼠胚胎干细胞克隆形成率，并且当质量浓度为100μg/mL时作用最为显著，结果见表1。

表1　不同质量浓度铁皮石斛多糖对m ES克隆形成率的影响（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

表1　不同质量浓度铁皮石斛多糖对m ES克隆形成率的影响（±s，n=3）Tab.1 CIonogenic assay ofm ES ceIIs treated w ith poIysaccharides from Dendrobium officinale（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

质量浓度/（μg·mL-1）克隆数/个增长率/% 0 310±6.56—25 315±6.03 0.93 50 353±8.74**7.6 100 378±8.62**13.67 200 327±6.66*3.33 400 305±6.24-0.93

3.2铁皮石斛多糖对mES增殖的影响 不同质量浓度的铁皮石斛多糖对mES作用不同时间的实验结果显示，铁皮石斛多糖质量浓度在50～200 μg/mL时，作用24、48和72 h对mES的增殖均有显著的促进作用，如图1；同一作用时间时，曲线均在铁皮石斛多糖质量浓度为100μg/mL时达到最高点，说明质量浓度为100μg/mL时促进作用最为显著，为促进mES增殖的最适宜浓度。

图1　不同质量浓度铁皮石斛多糖对m ES增殖的影响（±s，n=4）Fig.1　Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on proIiferation ofmES ceIIs（±s，n=4）

3.3铁皮石斛多糖对mES多潜能性的影响 qRTPCR结果显示，实验质量浓度范围内（50～400 μg/mL）铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞D3干性相关基因Oct4、Aire、Lin28的表达量无显著影响；50μg/mL的质量浓度可以提高Nanog、Sox2、K1f4的表达量，100μg/mL有利于Nanog、Rex表达量的提高，如图2。这些结果说明铁皮石斛多糖在促进mES的增殖的质量浓度范围内（50～200 μg/mL）并不影响其干性相关基因的表达，甚至有些质量浓度（如50，100μg/mL）还可以促进某些干性基因（如Nanog，Sox2，K1f4和Rex）的上调，因此铁皮石斛多糖在一定程度上有利于mES的自我更新及多潜能性的维持。

4　讨论

近年来，天然多糖的研究逐渐受到人们重视，多糖类作为一类信息物质参与机体分子和细胞识别，在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用［19］。石斛多糖是天然多糖中重要的一员，是铁皮石斛中重要的活性成分，关于石斛多糖的研究亦已有不少报道［8-12，14］，然而对其细胞药效学的研究较少，本实验研究了铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞的影响。胚胎干细胞具有自我更新的特性及分化为机体三个胚层来源的所有约220种成体细胞类型的潜能［20］，是研究早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学事件的一个理想模型，更重要的是人ES细胞可为临床上细胞移植、组织替代和器官克隆提供新的细胞来源［5-6］，为多种难治性疾病的治疗带来希望，具有重要的理论价值和广泛的医学临床应用前景。

图2　铁皮石斛多糖对m ES干性相关基因表达量的影响（±s，n=3）Fig.2　Effect of po Iysaccharides from Dendrobium officinale on the expression of m ES-marker genes（±s，n=3）

本实验从克隆形成率、增殖速率及多潜能性等方面初步研究了铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞的作用，对于更好地理解和调控胚胎干细胞在体外培养中的行为、诱导胚胎干细胞的定向分化、以及了解胚胎发育过程的机制等有重要的意义。然而铁皮石斛粗多糖作用于小鼠胚胎干细胞的具体机制尚需要进一步的探讨，此外，对于人的胚胎干细胞及其他类型的干细胞如骨髓干细胞、神经干细胞等是否有不同药效也需进一步的探索研究。

致谢

本实验在浙江大学生命科学学院张铭教授的实验室进行，向赵小立老师及实验室的所有同学表示由衷的感谢。

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Effect of poIysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ceIIs

LIU Ya-juan1，3， WU Jiang-1in2， WANG Shi-hao3， ZHANG Ming3， HUA Yun-fen1*
（1.Pharmaceutical College，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310012，China；2.Pesticide Verification Management of Zhejiang Province，Hangzhou 310020，China；3.College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

AIM To study the effect of po1ysaccharides from Dendrobium officinale on mouse embryonic stem ce11s.METHODS Po1ysaccharides from Dendrobium officinale were pre1iminari1y extracted in water and precipi-tated in ethy1a1coho1and purified by removing proteins，then app1ied tomouse embryonic stem ce11s（mES）which were cu1tured in vitro for 24、48 and 72 hours at different concentrations.C1onogenic assay and MTTmethodswere used to determine ce11activity and pro1iferation and qRT-PCRmethod was used to detect the re1evant expression of mES-marker genes.RESULTS The resu1ts showed that the c1oning efficiency and MTT absorbance in po1ysaccharides from Dendrobium officinale（50-200μg/mL）group were higher than that of the contro1 group，meanwhi1e，there was not significant difference in the re1evant expression ofmES-marker genes between the two groups. CONCLUSION Po1ysaccharides from Dendrobium officinale can marked1y promote the pro1iferation and c1oning efficiency ofmES ce11swith unchanged p1uripotency.

Dendrobium officinale；po1ysaccharides；mouse embryonic stem ce11s（mES）；pro1iferation

R285.5

A

1001-1528（2015）01-0012-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.003

2014-03-12

浙江省自然科学基金（LQ12C02003）

刘亚娟（1987—），女，硕士生，主要从事研究药物分析及胚胎干细胞方向的研究。Te1：15868840442，E-mai1：1iu_yajuan @126.com

华允芬，男，副教授，主要从事天然活性多糖的化学成分及药理药效学研究。Te1：13173696879，E-mai1：huayfyxwd@ hotmai1.com