GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

林豪雨，郭昱显，林芳芳，孙淑明，卢晓峰，梁伟全，陈春发

（1.汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺外科，2.汕头大学医学院长江学者实验室　广东　汕头　515041）

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

林豪雨1，2，郭昱显2，林芳芳2，孙淑明1，卢晓峰1，梁伟全1，陈春发1

（1.汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺外科，2.汕头大学医学院长江学者实验室广东汕头515041）

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色，研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板，以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列，将片段克隆到pGL3-Basic载体内，鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示，成功构建了GATA-3启动子报告基因，并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc，为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.

乳腺肿瘤；GATA-3；启动子；报告基因

GATA-3属于GATA转录因子家族，是乳腺腔上皮细胞的重要标志，在乳腺腔上皮细胞发生及维持分化有重要作用［1］.GATA-3与ERa同时高表达于luminal型乳腺癌细胞（如MCF-7、T47D），具有高度相关性，GATA-3对ER有调控作用，可能是ER通路的重要组成部分［2］.多个研究表明GATA-3在乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色，是乳腺癌良好预后的指标，可以通过逆转EMT、改变肿瘤的微环境，抑制新生血管形成，负性调控多个癌基因等抑制乳腺癌的转移［3-4］.目前对GATA-3的研究集中在对其下游基因的探讨，对其上游基因及调控机制报道较少.本研究旨在明确GATA-3的转录调控启动子区域，克隆其启动子区，并鉴定其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的活性.为以后靶向调节GATA-3启动子活性奠定基础.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

质粒pGL3-basic、pGL3-control、pRL-SV40为笔者实验室保存；E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞（Takara公司）；MCF-7细胞系购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库.

1.1.2主要试剂

细胞培养液：DMEM-HG（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；核酸电泳所需材料：DNA ladder（中科瑞泰公司），Agarose（GIBCO公司），1×TBE电泳缓冲液，GelRED（41003 Biotium），6×Loading Buffer（Takara公司）；DNA限制性内切酶均购自宝生物公司；质粒制备试剂盒（minipreparation and maxipreparation）均购自天根生物有限公司（DP103，DP117）；FastPfu高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司AP221）；T4 DNA Ligase（北京全式金生物技术有限公司FL101）；去磷酸化酶CIP（NEB Lot：0621301）；胶回收试剂盒（Thermo Scientific GeneJET#K0691），组织、细胞DNA提取试剂盒（GENSTAR-DNAzol-D104-01），Dula-Luciferas Reporter Assay system试剂盒（Promega公司），Lipofectamine 2000（invitrogen公司）

1.2方法

1.2.1GATA-3启动子引物设计

我们利用美国UCSC Genome Browser网站（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）对GATA-3基因进行分析，在人GATA-3基因（NC_000010.11）转录起始位点-1 200 bp和+200 bp之间设计引物，引物设计确保克隆后的插入片段不影响Luciferase的阅读框.合成由上海生工生物技术公司完成.上游序列：hGATA-3 pro-F 5'GCGCAAGCTTAGGGCTGG TTTCCTTGACTG 3'，酶切位点：Hind III.下游序列：hGATA-3 pro-R 5'GCGCCTCGAGGTCACCAGTACCAACCTGGG 3''，酶切位点：Xho I（下划线序列是酶切位点）.总长度为1 191 bp.

1.2.2MCF-7细胞培养

人乳腺癌MCF-7细胞贴壁培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM basic培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中常规传代，取对数生长期细胞进行试验.

1.2.3基因组DNA提取

选择60 cm2培养瓶中聚合度达到80%的MCF-7细胞，按照GENSTAR-DNAzol组织、细胞DNA提取试剂盒方法，提取基因组DNA.-20℃保存备用.

1.2.4GATA-3启动子扩增

以1.2.3提取的DNA为模版PCR，PCR体系如下：5×Buffer 5 μL；2.5 mM dNTP 2.5 μL；20 pmol上游引物1 μL；20 pmol下游引物1 μL；FastPfu DNA聚合酶0.25 μL；DNA模板1 μL；加灭菌水至25 μL.PCR反应条件：95℃预变性5 min，循环条件：94℃30 s，55-60℃梯度退火温度45 s，72℃45 s，30个循环，72℃延伸5 min，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳观察.

1.2.5构建GATA-3启动子pGL3-GATA-3pro-Luc

按照胶回收试剂盒的说明对PCR产物进行回收纯化，用Hind III和Xho I进行双酶切；同样将载体质粒pGL3-Basic用Hind III和Xho I进行双酶切，并用去磷酸化酶CIP处理防止其自连；PCR产物与载体的连接反应按TransStart T4 DNA Ligase试剂盒说明书进行.按照插入片段与载体的摩尔比例为3∶1进行连接.连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜；次日摇菌提取质粒.Hind III和Xho I进行双酶切，阳性克隆命名为pGL3-GATA-3pro-Luc.质粒送上海生工生物技术公司测序鉴定.

1.2.6重组质粒pGL3-GATA-3pro-Luc转染MCF-7细胞

在24well培养皿中用含有10%FBS无双抗的DMEM培养基培养MCF-7细胞到汇合度达60%进行转染；采用脂质体转染方法分别在每孔中加入海肾荧光素酶质粒pRL-SV40作为内参，以及分别加入GATA-3启动子报告基因pGL3-GATA-3pro-Luc/阴性对照pGL3 basic luc/阳性对照pGL3 control.在37℃，5%的二氧化碳中培养.

1.2.7GATA-3启动子报告基因活性检测

上述细胞转染24 h后裂解细胞，采用Promega公司的双荧光报告基因检测系统分别检测实验组和对照组的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶（内参）活性，以两者的活性比值作为荧光素酶的相对活性.

2　结果

2.1GATA-3启动子基因的PCR扩增

利用设计的引物以及55-60℃梯度退火温度（泳道1-6退火温度递减）PCR扩增得到的产物（图1），发现在Marker DL2000的1 000-2 000 bp间靠近1 000 bp左右1-6个泳道均有一条特异的条带.而我们预扩增的GATA-3启动子部分大小约1 191 bp（加两端酶切位点及保护碱基）.因此，从图片结果可以看出，PCR扩增出来的条带大小与预计的GATA-3部分启动子大小一致，从而证明GATA-3启动子已经成功扩增出来，且无其他非特异性片段，对产物1-6泳道1%琼脂糖凝胶分离并切胶回收.

2.2GATA-3启动子载体的构建及鉴定

回收经Hind III和Xho I双酶切得到的GATA-3启动子基因和pGL3-Basic载体的相应条带，经T4连接酶连接后转化DH5α感受态细菌.37℃培养过夜；次日摇菌提取质粒，再以Hind III和Xhol I双酶切后，重组质粒释放出1 191 bp大小左右的片段（图2）.质粒送经上海生工生物工程公司测序，结果用DNAMAN软件与GenBank基因序列进行同源性比较，证实扩增产物为目的基因.构建质粒载体命名为pGL3-GATA-3pro-Luc.

2.3GATA-3启动子报告基因荧光素酶活性的检测

我们把pGL3-GATA-3pro-Luc转染到MCF-7细胞中，并设pGL3 control为阳性对照，pGL3 basic为阴性对照.并共转染相同量的海肾荧光素酶质粒pRL-SV40作为内参照，以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶的比值来反应报告基因的驱动活性.结果显示pGL3-GATA-3pro-Luc的相对荧光素酶活性为pGL3 basic的12.8倍（图3），说明pGL3-GATA-3pro-Luc质粒能表达荧光素酶活性代表GATA-3的启动子活性.

3　讨论

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤.在欧美国家，其发病率位于女性恶性肿瘤之首，约占29%，死亡率约为15%，仅次于肺癌，位居第2位［5］.乳腺癌发生发展的机制尚未得到十分明确的阐述，现在普遍认为其受多种因素与多条信号通路相互作用的结果.

图1　55-60℃梯度退火温度（泳道1-6退火温度递减）PCR扩增得到的产物

图3　在MCF-7细胞株中分别转染了同等剂量的pGL3 basic、pGL3-GATA-3pro-Luc、pGL3 control，以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶的比值来反应报告基因的驱动活性.差异倍数以平均值±标准差方式给出（*，p＜0.05，t-检验）.

GATA-3作为转录因子不仅在正常乳腺组织的发生发展中起重要的调节、促分化作用，而且与乳腺癌的发生发展密切相关.目前的研究显示［6］，GATA-3在乳腺癌中高表达，是乳腺癌特异性标志之一.这一点在Luminal型乳腺癌中更为明显，并且与较好的预后相关.Marie-Liesse Asselin-Labat等［7］对luminal型乳腺癌转基因小鼠MMTV-PyMT的研究发现，缺失GATA-3等位基因会导致肿瘤形成明显加速，而重新过表达GATA-3则能使这一过程减缓.进一步研究表明GATA-3的这一抑癌作用是通过对其下游一种抑癌基因Caspase-14的调控实现的。Wei Yang等［8］认为GATA-3可以通过逆转EMT的过程抑制乳腺癌转移，而进一步的研究表明其逆转是建立在对E-cadherin启动子水平调控的基础上的.Jianwei Sun等［9］认为GATA-3能消除转化生长因子TGFβ和Smad4所导致的肌成束蛋白（Fascin）的过表达从而抑制乳腺癌的侵袭和转移，而Fascin的高表达是乳腺癌浸润转移的重要机制之一.Jonathan Chou等［4］研究表明GATA-3通过调控microRNA-29b抑制肿瘤的转移，而microRNA-29b可以通过作用于包括VEGFA，ANGPTL4，PDGF，LOX，MMP9，ITGA6，ITGB1和TGFB等一系列靶基因改变肿瘤的微环境，包括抑制新生血管形成，基质破坏，上皮间质转换.从而抑制肿瘤的转移.这一发现可能为转移性乳腺癌的治疗提供新型靶点.最近的研究［10］证实GATA-3在乳腺癌中可通过形成一个转录抑制因子复合物GATA-3/G9A/NuRD（MTA3）下调ZEB2的表达，而锌指蛋白ZEB2是公认的EMT的关键基因之一，从而最终抑制乳腺癌的远处转移.GATA-3对乳腺肿瘤的抑制作用在众多研究中得到证实，但是对其上游基因的研究，对GATA-3本身的调控研究，在国内外都报道较少.

本研究利用PCR方法构建了GATA-3启动子序列，并将其插入到pGL3 basic luc质粒载体中，构建了GATA-3启动子报告基因质粒.通过转化扩增，筛选出阳性克隆，并通过酶切，测序鉴定及生物学活性的检测，结果表明，本组成功地构建了pGL3-GATA-3pro-Luc荧光素酶报告基因载体，并在MCF-7细胞内鉴定了其荧光素酶的表达.因此，充分证明了本组构建的pGL3-GATA-3pro-Luc是具有生物学功能的，为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.

［1］HOSEINK M，EUAN M，SLORACHMD，et al.GATA-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland［J］.Cell，2006，127（5）：1041-1055.

［2］LicataL A，Hostetter C L，Crismale J，et al.The RNA-binding protein HuR regulates GATA3 mRNA stability in human breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，122（1）：55-63.

［3］Chu I M，Michalowski A M，Hoenerhoff M，et al.GATA-3 inhibits lysyl oxidase mediated metastases of human basal triple-negative breast cancer cells［J］.Oncogene，2012，31（16）：2017-2027.

［4］Chou J，Lin J H，Brenot A，et al.GATA-3 suppresses metastasis and modulates the tumour microenvironment by regulating microRNA-29b expression［J］.Nature Cell Biology，2013，15（2）：201-213.

［5］Torre L A，Bray F，Siegel R L，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［6］Yang M，Nonaka D.A study of immunohistochemical differential expression in pulmonary and mammary carcinomas［J］.Modern Pathology，2010，23（5）：654-661.

［7］Asselin-Labat ML，Sutherland K D，Vaillant F，et al.GATA-3 negatively regulates the tumor-initiatingcapacity of mammary luminal progenitor cells and targets the putative tumor suppressor caspase-14［J］.Mol Cell Bio，2011，31（22）：4609-4622.

［8］Yan W，Cao Q J，Arenas R B，et al.GATA-3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition［J］.J BiolChem，2010，285（18）：14042-14051.

［9］Sun J W，He H F，Pillai S，et al.GATA-3 transcription factor abrogates Smad4-mediated fascinoverexpression invadopodiumformation and breastcancer cellinvasion［J］.JBioChem，2013；288（52）：36971.

［10］Si W Z，Huang W，Zheng Y，et al.Dysfunction of the reciprocal feedback loop between gata-3 and zeb2-nucleated repression programs contributes to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell，2015，27（6）：822-826.

Construction and Activity Analysis of Luciferase Reporter Gene Vector Containing GATA-3 Promoter

LIN Haoyu1，2，GUO Yuxian2，LIN Fangfang2，SUN Shuming1，LU Xiaofeng1，LIANG Weiquan1，CHEN Chunfa1
（1.DepartmentofThyroidandBreastSurgery，TheFirstAffiliatedHospital，ShantouUniversityMedicalCollege，Shantou515041，Guangdong，China；2.Changjiang Scholar's Lab，Shantou University Medical College，Shantou 515041，Guangdong，China）

Objective:GATA-3 is a transcription factor that plays crucial role in carcinogenesis and development of breast cancer，and thus the investigation of its transcription regulation is important for understanding the mechanism of breast cancer.Methods:The gene fragment of promoter sequence of GATA-3 was amplified from human breast cancer cell line MCF-7 by PCR and was cloned into empty vector pGL3-Basic to construct luciferase reporter gene vectors pGL3-GATA-3pro-Luc，which was amplified by transformation and identified by restriction enzyme digestion，sequencing，and the biological activity detecting.Results:The Slug promoter driven fluorescence protein was effectively expressed in human breast cancer cell line MCF-7.We constructed the luciferase reporter vector pGL3-GATA-3pro-Luc successfully，the expression of luciferase could be detected in human breast cancer cell line MCF-7.Conclusion:Luciferase reporter vector pGL3-GATA-3pro-Luc is constructed successfully.It lays a solid foundation for the research of GATA-3 regulation in breast cancer，and may guide to identify newtargets for breast cancer therapy.

breast neoplasm；GATA-3；Promoter；Reporter gene

R737.9

A

1001-4217（2016）03-0069-06

2015-12-17

林豪雨（1982—），男，广东汕头市人，博士生，主治医师，汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺科.主要从事乳腺癌浸润转移机制研究.

陈春发（1982—），男，广东汕头市人，硕士，主治医师，汕头大学医学院第一附属医院甲状腺乳腺科.主要从事乳腺癌浸润转移机制研究.E-mail：zjgdmc-2001@163.com

广东省自然科学基金资助项目（2015A030313429）；广东省医学科学技术基金项目（A2015437）