聚合酶链式反应技术在食品微生物检测中的应用进展

王　栋， 王　旭(综述), 陈　卓(审校)



聚合酶链式反应技术在食品微生物检测中的应用进展

王栋1,2， 王旭1,2(综述), 陈卓2,3(审校)

聚合酶链反应； 微生物学技术； 食品

随着人们生活水平的不断提高以及世界食品开发、生产、销售的迅速发展，研究和建立食品微生物快速检测方法，以加强对食品卫生安全的监测越来越受到各国科学家们的重视。近日，国家质检总局发布的《2015年上半年中国进口食品质量安全状况》中显示：2015年上半年，我国从57个国家或地区的进口食品中退运或销毁不合格进口食品共计4 960吨。调查发现，微生物污染是进口食品不合格的主要原因之一。如何快速、准确地检测食品病原微生物含量是保障食品安全的关键，也对促进食品行业健康发展具有深远意义。

目前对食源性致病菌检测主要采用传统方法，包括培养法、血清学分析法等，这些检测方法存在步骤繁琐、费时费力、特异性差和不易分辨结果等缺点。近年来，随着微生物学、生物化学和分子生物化学、微生物快速检测和自动化研究的迅速发展，对微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而在分子生物学水平基础上建立的众多检测技术中，除了核酸探针及基因芯片技术外，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术以其具有特异强、灵敏度高、操作简便、成本低等优点，越来越多地被用于食品微生物的检测[1-2]。笔者就近年来利用PCR技术在食品微生物检测方面的研究进行简要综述。

1　PCR技术在食品微生物检测中的应用

PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。Khorana等在1971年提出，在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再利用DNA聚合酶延伸、克隆DNA的设想。1983年，美国科学家Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现[3]。1988年，Saiki等将耐热DNA聚合酶引入了PCR技术。1989年，《Science》杂志将PCR技术列为十余项重大科学发明之首，并将1989年喻为PCR爆炸年，而Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。PCR技术的原理是：在微量离心管中，加入适量缓冲液、微量的模板DNA、4种脱氧核苷酸、1对合成DNA的引物、耐热DNA聚合酶，通过高温变性、低温退火和中温延伸3个阶段为1个循环，每次循环使特异区段的基因拷贝数放大1倍。一般样品经过30次循环，最终使特异区段的DNA片段得以扩增数百万倍。最早利用PCR技术扩增出的DNA序列是人的β-球蛋白基因，并于1987年6月首次进入临床应用。但是，PCR技术作为一个单纯的实验技术，其反应及其产物受到很多因素影响，随着有关DNA提取、引物设计、反应温度、扩增产物的分析技术等研究成果逐渐增多，国内外许多学者根据不同需要，对常规PCR技术进行了改进，开发出许多新类型的PCR技术，使之成为一个较为完善的技术体系。

PCR技术在食品微生物检测方面研究的重点在于及时、准确地检测出食品中的病原微生物含量，尤其是近年来引起人们广泛关注的导致食品污染的主要病原菌。利用PCR技术对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测，具有特异性高且灵敏、快速等特点。利用该技术建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)方法，并检测模拟污染生猪肉、水和牛奶，其检测限可达10 CFU/25 g(mL)。近年来，随着PCR技术的改进以及与其他技术的结合，衍生的新技术也为实验设计提供了新的选择。这些衍生的新技术除具有PCR技术的共性以外，均有各自的优缺点及试用的PCR方式(表1)。

1.1多重PCR技术该技术的原理与常规PCR相同，不同之处在于多重PCR技术在同一反应体系中加入了2对以上的特异性寡核苷酸引物，可以同时扩增多个目的基因或DNA序列。因此，多重PCR技术可用于同时检测或鉴定多种病原微生物。2010年，Çadlrcl等利用免疫磁分离技术和多重PCR技术相结合的方法，开展了对碎牛肉和生肉丸中大肠杆菌O157∶H7流行因子的检测[4]。同年，Camila等也报道了利用多重PCR技术可特异性扩增沙门氏菌属特异性基因ompC、肠炎沙门氏菌SdfI基因、伤寒沙门氏菌ViaB基因以及鼠伤寒沙门氏菌Spy基因的目的片段[5]。利用该技术对沙门氏菌的检出率明显高于常规的微生物培养法，并成功检测巴西境内冷冻家禽肉的沙门氏菌污染情况及其常见血清型的流行情况。

表1　不同PCR技术在食品微生物检测中的应用

然而，多重PCR技术存在扩增效率不高、扩增条件需要摸索及兼顾协调等不足之处，易出现多对引物间相互干扰以及交叉抑制等现象。其中，扩增敏感性偏低是其在微生物检测应用中受限制的关键因素。美国贝克曼库尔特公司为此将该技术与毛细管电泳技术结合，推出了用于同时检测多种微生物的GenomeLabTMGeXP多功能遗传分析系统(简称GeXP)[6]。

1.2qPCR技术该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，进行实时监测整个PCR进程[7]，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且具有特异性强、自动化程度高等特点[8]。

qPCR技术中涉及到的荧光有2种：一种是荧光探针，如TaqMan荧光探针；另外一种是荧光染料，如SYBR荧光染料。曹东林等通过探针qPCR技术对血清型肺炎链球菌进行检测，发现qPCR技术不仅增强检测的特异性，而且提高了检测的灵敏度[9]。沈飚等比较了TaqMan探针qPCR、RT-PCR和常规PCR 3种方法在检测白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、桃拉综合征病毒及黄头病毒4种对虾病毒的不同，发现利用TaqMan探针进行实时qPCR的检测，灵敏度可提高10～100倍[10]。然而，定量PCR技术检测核酸分子往往依赖于基于标准品的标准曲线，并且定量检测的准确与否，很大程度上依赖于标准物质的准确定标[11]。

1.3巢式PCR技术该技术是随着系统发生学与基因组学的发展而出现的一种变异的PCR。该技术使用2对PCR引物扩增完整的片段，第1对PCR引物扩增片段和普通PCR相似；第2对引物是在第1次PCR扩增片段的基础上设计的，称为巢式引物。巢式PCR首先通过外引物对样品DNA进行扩增，得到大量扩增产物后，再由内引物进行扩增。这种巢式PCR技术可得到大量的特异性目标序列，显著增加了检测的灵敏度[12]。如在运用巢式PCR技术联合焦磷酸测序法检测乙型肝炎病毒的耐药基因中，发现巢式PCR在低拷贝数条件下较常规PCR更具敏感性，尽管其对最低基因拷贝数有一定要求。此外，巢式PCR技术还可防止反应结束时的非特异性扩增[13]。

1.4PCR-SSCP技术该技术是利用DNA单链构象具有多态性、在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移速率不同，通过显色或显影可以检验出小至单个碱基的差异。该技术快速、廉价、简便、精确，适用于对大样本基因突变的筛选。目前，PCR-SSCP技术在致病微生物的快速检测、种属鉴定、微生物分型和微生物群落组成及多态性分析等工作中发挥着越来越重要的作用。据报道，胡秀彩等运用传统的形态学观察和生理生化特征实验，鉴别了从草鱼肠道中分离的属于同一分支类群的3株细菌，通过PCR-SSCP分析，发现它们的16S rDNA V3区带型明显不同，具有基因的多态性[14]。研究表明，PCR-SSCP技术具有很好的菌株鉴别效果，在微生物病原菌诊断中具有良好的应用前景。

1.5ddPCR技术该技术的出现使病原微生物的分子检测技术获得巨大的飞跃，该技术通过在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，每个微滴都相当于一个独立的反应室。在每个微滴中，可以单独完成核酸的扩增，然后通过微滴分析系统逐个对微滴进行检测，最终根据阳性微滴的比例以及泊松分布原理，可计算出待测DNA分子的浓度或拷贝数[15]。

继2013年欧洲马肉风波之后，公众对于食品具体成分及含量愈发关注。德国科学家Floren采用ddPCR方法检测肉类制品成分，结果显示：ddPCR技术对不同肉类制品成分进行的定量分析中，检测限和定量限可分别达0.01%和0.001%水平，优于qPCR的表现[16]。Michael在运用ddPCR对葡萄金黄病致病菌类菌原体进行检测中，通过对葡萄藤的3种不同组织进行实测，发现qPCR与ddPCR的检测灵敏度都能达到10-5的水平，但ddPCR具有更好的重复性[17]。相对于qPCR，ddPCR这种本质上基于单分子计数的核酸定量方法，可实现对病原微生物特定核酸分子的绝对定量，从而彻底摆脱qPCR对于标准曲线的依赖，在检测结果的灵敏度、重复性等方面有更好的表现，并且抑制剂对ddPCR的影响也较小[18]。ddPCR有望取代qPCR作为未来定量检测的发展方向[19]。

2　PCR技术在检测食品微生物中的优势及应用展望

用传统的方法检测食品中的微生物需要分离出所有的微生物，而食品中污染微生物的种类繁多，即使是同一种食品中微生物的种类也相当多，毋庸置疑，快速、准确和灵敏的PCR技术，尤其是通过对传统PCR技术的改进以及与其他分子生物学技术的联合使用[20-21]，在对环境、食品中微生物(尤其针对病原性微生物)的检测中已成为一种重要科学手段。此外，一般的腐败菌检测需要2～5 d，甚至7 d以上，待检验结果出来时通常产品已经流向市场，对实际生产具有严重的滞后性。相比之下，PCR技术检测食品微生物可以在1 d内，甚至在几个小时内就可以得到检测结果，对食品工业生产具有很好的指导作用。

同时，我们应该看到，PCR技术应用于食品微生物检测中存在的一些问题，包括由于食品成分复杂，如果不能有效排除各因素的干扰(如蛋白质等PCR抑制剂对PCR反应造成污染)可能出现假阴性；PCR技术无法区分微生物细胞是死细胞还是活细胞；PCR反应灵敏度高，操作时要求严格，稍不注意有外界DNA介入就会造成假阴性等。此外，对于特定的PCR系统，不同实验室的标准不尽相同，PCR技术的“标准化”任务依然任重道远。近年来，随着新兴的分子生物学技术的发展，出现了一些用于微生物分析的PCR检测商品试剂盒。笔者相信，随着分子生物学技术的不断发展，PCR技术在微生物检测上的应用将朝着简便、高效、特异性强的方向发展。以PCR技术为基础，并结合传统的微生物培养鉴定技术，势必在微生物检测中拥有广阔的发展空间。

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(编辑：常志卫)

2015-10-26

国家自然科学基金面上项目(81171634)；福建省自然科学基金(2013J01387)

1.福建师范大学 生命科学学院，福州350117；2.中国科学院 福建物质结构研究所，福州350002；3.中国科学院大学，北京100049

R155.5； R446.5； R446.9； R595.7

A

1672-4194(2016)03-0213-04